Thèse soutenue

Caractérisation d’un nouveau domaine de fixation à l’ADN dans le N-terminus de BRCA2 et évaluation des variantes BRCA2 non-classifiées identifiées dans les patients de cancer du sein dans la même région

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Auteur / Autrice : Catharina von Nicolai
Direction : Aura Carreira
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Date : Soutenance le 13/06/2016
Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Intégrité du génome, ARN et cancer (2010-....)
établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
Jury : Président / Présidente : Simon Saule
Examinateurs / Examinatrices : Aura Carreira, Simon Saule, Isabelle Callebaut, Mauro Modesti, Sophie Zinn-Justin, Jean-Baptiste Charbonnier
Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Callebaut, Mauro Modesti

Mots clés

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Résumé

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Les mutations héréditaires dans le gène BRCA2 sont associées à une forte susceptibilité au développement du cancer du sein et de l’ovaire. La protéine suppresseur de tumeur BRCA2 est essentielle pour préserver l’intégrité des chromosomes après endommagement de l’ADN. BRCA2 est impliquée dans la recombinaison homologue (RH), une voie fiable de réparation des cassures de l’ADN. BRCA2 exerce aussi un rôle pendant la mitose afin d’assurer un point de contrôle et une division cellulaire correcte. Bien que le rôle de BRCA2 dans la RH soit bien établi, la littérature décrive une restauration partielle de la fonction de RH dans des cellules ne possédant pas le site de liaison à l’ADN en C-terminal (CT-DBD), ce que nous a encouragé à voir s’il existait un domaine secondaire de liaison à l'ADN. L'analyse in silico a révélé un domaine zf-PARP putatif dans la région N-terminale. Normalement, ce type de domaine s’associe à l’ADN, ce que nous a porté à l’examiner. En utilisant des fragments purifiés de la partie N-terminale comprenant le site putatif dans des analyses de changements de mobilité électrophorétique, nous avons montré une activité de liaison à l’ADN. En comparaison avec le CT-DBD canonique, le site de liaison à l’ADN en N-terminal (NT-DBD) manifeste une affinité plus forte pour divers substrats et contrairement du CT-DBD il est capable de s’associer à l’ADN à double brin. En utilisant des tests d’échange de brin, nous avons également montré que le NT-DBD peut stimuler la fonction de recombinaison de RAD51. De plus, des variantes faux-sens dans le NT-DBD trouvé chez les patients atteints de cancer du sein ont montré une activité réduite d’association à l’ADN et une stimulation diminuée de l’activité de RAD51 ce qui implique que ces amino-acides sont importants pour les deux fonctions. Ce travail révèle un nouveau sitede liaison à l’ADN, ce qui contrairement au CT-DBD est capable de s’associer à l’ADN double-bras(db) et stimuler l’activité de recombinaison de RAD51. Nous proposons que le NT-DBD positionne RAD51 à la jonction entre ADNdb et ADNsb, ce qui facilite le chargement de RAD51 sur l’ADN recouvert de RPA. Cette activité pourrait promouvoir la RH pendant la réparation des cassures de l’ADN (von Nicolai, C et al., 2016, under revision).Afin de définir la prévalence des mutations de NT-DBD pour la prédisposition au cancer, nous avons sélectionné des variants faux-sens non-classifiés (variants of unknown clinical significance), identifiés dans des familles à risque élevé de développer un cancer du sein. Nous avons effectué des tests afin d’étudier l’impact de ces variants sur la fonction de BRCA2 dans la RH et la mitose. Certains de ces variants ont conduit à une hypersensibilité aux agents endommageant l’ADN et aux inhibiteurs de PARP, caractéristique d’une RH défectueuse alors qu’un de ces variants était compétent pour la réparation. Tous les variants ont induit une duplication normale des centrosomes, mais la cytokinèse était défectueuse. Ce phénotype suggère un défaut dans la formation du midbody et de l’abscission. Cette étude aidera à classifier les VUS dans le NT-DBD et facilitera la consultation génétique pour des individus. BRCA2 est un médiateur de la RH dépendante de RAD51. Son homologue méiotique, DMC1, partage structure et fonction similaire et s’associe à BRCA2. Néanmoins, la pertinence fonctionnelle de cette interaction reste élusive. Nous avons montré que BRCA2 interagit avec DMC1 au travers des répétitions BRC et promeut la formation de molécules d'adhérence. Cet effet stimulant est dû au renforcement de la liaison de DMC1 à l’ADN. BRCA2 complet et fonctionnel était surtout capable de stimuler l’activité d’échange de brin de DMC1, ce qui confirme les résultats obtenus avec les répétitions BRC. Nos résultats identifient BRCA2 comme une protéine de médiation de la recombinaison méiotique et renforcent le rôle des répetitions BRC dans cette fonction (Martinez, von Nicolai, et al., PNAS, 2016).