Développement et caractérisation d’un modèle polyploïde chez les espèces de Brachypodium

Development and characterization of the Brachypodium species polyploid model

• Auteur / Autrice : Thi Vinh Ha Dinh
• Direction : Boulos Chalhoub
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 27/09/2016
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et dynamique des systèmes vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université d'Évry-Val-d'Essonne (1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Structure et activité des biomolécules normales et pathologiques (Evry, Essonne ; 2007-....)
• Jury : Président / Présidente : Marie Dufresne
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Malika Ainouche, Etienne Paux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Hybridation végétale

Plantes -- Expression génique

Polyploïdie

Mots clés libres

Brachypodium

Résumé

La polyploïdie consiste en la duplication du génome entier et constitue une force évolutive majeure chez les eucaryotes, notamment chez les angiospermes. Les espèces du genre Brachypodium ont émergé comme une modèle intéressant des monocotylédones. Parmi ces espèces, l’allopolyploïde B. hybridum (2n = 30) a résulté de l’hybridation entre B. distachyon (2n = 10) et B. stacei (2n = 20). Les deux espèces parentales ont eu des évolutions chromosomiques assez divergentes aboutissant à ce que B. distachyon possède deux fois moins de chromosomes qui sont néanmoins deux fois plus grands que ceux de B. stacei.L'objectif de ma thèse est de développer un modèle de Brachypodium polyploïde en synthétisant des autopolyploïdes et des allopolyploïdes ainsi que les caractérisant aux niveaux phénotypique, cytogénétique et génomique.Les autotétraploïdes ont été générées par traitement à la cochicine de deux lignées de B. distachyon et trois autres de B. stacei. Tous les autopolyploïdes obtenues ont été validés par cytométrtie de flux et ont montré une stabilité de caryotype et de phénotype, exceptés ceux de la lignée ABR114 de B. stacei qui ont montré des descendances autotetraploides et aneuploïdes. Les comparaisons des caractères de l’inflorescence et des ligules montrent que les autotétraploïdes des deux espèces dépassent généralement leurs progéniteurs diploïdes, mais une faible fertilité comme illustré par le faible nombre de graines par inflorescence.Les allotétraploïdes synthétiques, similaires à B. hybridum, ont été générés par hybridation interspécifique entre différentes lignées de B. distachyon et B. stacei. Alors que les hybrides interspécifiques F1 stériles ont été obtenus lorsque B. distachyon a été utilisée comme parent maternel (0,15% ou 0,245% des croisements réalisés), aucun hybride a été obtenu à partir des croisements réciproques ou lorsque des plantes autotetraploïdes des espèces parentales ont été croisées. Le doublement du génome par traitement à la colchicine a restauré la fertilité et les plantes F1 doublées produisent par auto-polllinisation quelques graines S1 (première génération autofécondation). Les plantes S1 de la l’allo3-1×5 étaient fertiles donnant des générations suivantes alors que ceux de l’allo21×114 étaient stériles. Ces allotétraploïdes se sont montrées stables au niveau phenotypique, cytogénétique et génomiques, ressemblant ainsi le B. hybridum naturel.J’ai ainsi utilisé la méthodologie Illumina de nouvelles générations de séquençage pour caractériser ces différents polyploïdes aux niveaux: (i) Des variations structurales par reséquençage de l’ADN, (ii) Le transcriptome par l'ARN-Seq afin de caractériser les modifications de l’expression des gènes (iii) la méthylation CpG par séquençage de l’ADN traité au bisulfite. Une large gamme de possibilités de comparaison pourrait être réalisée lorsque les séquences des génomes des trois espèces naturelles de Brachypodium seraient disponibles.La disponibilité de la séquence du génome de B. distachyon a permis de réaliser une analyse pilote comparant l’expression des gènes dupliqués dans les autopolyploïdes de la lignée Bd3-1 à ceux des diploïdes. Une expression similaire pour 95,25% des gènes a été observée et seulement 4,75% des gènes ont montrés une expression différentielle. La majeure partie de ces derniers (1053 gènes, 82%) étaient moins exprimés dans les autopolyploides. Des fonctions géniques tel que la ségrégation des chromosomes nucléaires, la réparation de l'ADN, la recombinaison homologue, la régulation de la transcription se sont révélées enrichies.La création des autopolyploides et allopolyploides et leurs caractérisations avec les outils NGS offrent la possibilité d’investir de façon intégrée les secrets de succès des polyploïdes.

Polyploidy consisting in whole genome duplication is an important evolutionary force widespread in eukaryote and very prominent in angiosperms. Species of the plant Brachypodium genus emerged as an important monocot and polyploid model. Among these species, the annual allopolyploid B. hybridum (2n=30), derived from hybridizations between B. distachyon (2n=10) and B. stacei (2n=20), was shown to be polyphyletic. The two parental species have similar genome content and ploidy level but an asymmetric chromosome evolution where B. distachyon has two times less chromosomes that are two times bigger than those of B. stacei.The objective of my PhD program consisted in developing a valuable Brachypodium polyploid model by synthesizing autopolyploids and allopolyploids and then their characterizing at the phenotype, cytogenetic and genomic levels.Autotetraploids were generated from two inbred lines of B. distachyon and three ones of B. stacei, through colchicine treatments. The genome doubling was validated by flow cytometry and karyotyping with fluorescent in situ hybridization analyses. All autopolyploids showed stability in phenotype as well as karyotype except those of line ABR114 of B. stacei that showed various aneuploid progenies. Quantitative comparison of inflorescences and flag leaves characters showed that both B. distachyon and B. stacei autotetraploids generally exceeded their diploid progenitors, but their fertility was reduced as illustrated by the lower number of seeds per inflorescence.Synthetic allotetraploids were generated through interspecific hybridization between various lines of B. distachyon and B. stacei species. While sterile amphihaploid F1 interspecific hybrids were obtained at low frequencies (0,15% or 0,245% of crosses) when B. distachyon was used as the maternal parent, no hybrids were obtained from reciprocal crosses or when autotetraploids of the parental species were crossed. Genome doubling through colchicine treatment restored fertility where doubled F1 plants produced a few S1 seeds (first selfed generation). S1 plants of allo3-1×5 were fertile and gave rise to further generations whereas those of allo21×114 were sterile. The synthetic allotetraploids were shown to be highly-stable and resembled the natural B. hybridum allopolyploid at the phenotypic, cytogenetic and genomic levels.I have used the Illumina next generation sequencing (NGS) methodology to characterize the different polyploids at the levels of: (i) The DNA resequencing to reveal genetic changes, (ii) The transcriptome analysis through RNA-Sequencing and (iii) CpG methylation through bisulfite sequencing. A total of 13 genotypes containing synthetic autopolyploids, synthetic allopolyploids and the natural diploid species B. distachyon, B. stacei and the allopolyploid B. hybridum have characterized. A wide range of possibilities of comparison could be then realized, when the genomes sequences of all three species will be available.The availability of sequence genome sequence of B. distachyon allowed a pilot gene expression comparison between diploids and autopolyploids of Bd3-1. Diploids and autotetrapolyploids of of Bd3-1 showed similar expression for most of the genes (95.25%). Only 4.75% of total genes were differentially expressed genes, the major proportion of which (1053 genes, 82%) were down-expressed in autotetraploids with important enrichment in genome maintenance functions such as nuclear chromosome segregation, DNA repair, DNA replication, homologous recombination.The successful creation of stable autotetraploids and synthetic B. hybridum allopolyploids together with genome wide characterization using NGS offer the possibility to unravel clues of success of polyploidy in angiosperms.