Étude des modifications du programme de réplication de l'ADN par séquençage des fragment d'Okazaki

Determination of DNA replication program changes between cancer and normal cells by sequencing of Okazaki fragments

• Auteur / Autrice : Xia Wu
• Direction : Olivier Hyrien, Ruohong Xia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 29/09/2016
• Etablissement(s) : Paris Sciences et Lettres (ComUE) en cotutelle avec East China normal university (Shanghai)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie de l'École normale supérieure (Paris ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation de la thèse : École normale supérieure (Paris ; 1985-....)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Fischer
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Olivier Hyrien, Ruohong Xia, Gilles Fischer, Benjamin Audit, Chunlong Chen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Biologie moléculaire

Mots clés libres

Programme de réplication du génome

Genome replication program

Okazaki fragment sequencing

Replication stress

Genome instability

Burkitt's lymphoma

Leiomyosarcoma

Magnetic field

Myc

Résumé

Jusqu'à présent, les modifications de la réplication de l'ADN entre cellules normales et cancéreuses ont été peu étudiées. Dans ce travail, nous avons utilisé le séquençage des fragments d'Okazaki, une technique récemment développée au laboratoire, pour déterminer la directionalité des fourches de réplication dans plusieurs lymphomes de Burkitt (LB), qui surexpriment l'oncoprotéine Myc à la suite de translocations chromosomiques spécifiques, ainsi que dans des lignées lymphoblastoides contrôles (LLC) et dans des léiomyosarcomes (LMS). Les profils de directionalité des fourches de réplication permettent de déduire la localisation et l'efficacité des sites d'initiation et de terminaison de la réplication le long du génome. Nous avons observé de nombreuses (~2000) différences de zones d'initiation entre les lignées Raji (LB) et GM06990 (LLC) ainsi qu'entre les lignées BL 79 et IARC385, une paire LB/LLC provenant d'un même patient. Nous avons détecté un nombre comparable de différences en comparant deux à deux les lignées étudiées. Cependant, les profils de BL79 et de Raji (deux LB) sont un peu plus proches l'un de l'autre que de la lignée contrôle GM06990. Ceci suggère l'existence de changements de la réplication récurrents dans les lignées LB. L'importance des différences observées entre les lignées IARC385 et GM06990 indique de façon surprenante une grande variabilité entre les LLC normales, provenant de différents individus. De façon intéressante, de nombreuses différences observées entre les lignées LB et LLC sont associées à des changements de l'expression des gènes ou de la liaison de l'oncoprotéine Myc. La comparaison des profils des deux LMS avec tous les profils disponibles au laboratoire montre que c'est à celui de fibroblastes normaux (IMR90) qu'ils ressemblent le plus. Ceci suggère que les cellules de tumeurs musculaires lisses auraient subi une transformation fibroblastique au cours de la tumorigénèse. Des données récentes suggèrent que les champs magnétiques peuvent perturber certains processus cellulaires comme l'assemblage du cytosquelette. Nous avons utilisé le séquençage de fragment d'Okazaki pour rechercher d'éventuels effets d'un champ magnétique sur la réplication de l'ADN chez la levure. Aucun effet du champ magnétique sur la directionalité des fourches de réplication n'a été détecté.

Changes in DNA replication profiles between cancer and normal cells have been poorly explored. In this work, sequencing of Okazaki fragments, a novel methodology developed in the laboratory, was used to determine replication fork directionality (RFD) in several Burkitt's lymphomas (BL), which overexpress the Myc oncoprotein due to specific chromosomal translocations, and control normal lymphoblastoid cell lines (LCL), and in leiomyosarcomas (LMC). RFD profiles allow to infer the location and efficiency of replication initiation and termination sites genome-wide. A larger number (~2000) of differences in replication initiation zones were observed genome-wide between Raji (BL) and GM06990 (LCL), and between BL79 and IAR385, a BL / LCL pair of cell lines established from a single patient. Comparably large numbers of changes were slightly more similar to each other than to GM06990. This suggests the occurrence of some recurrent replication changes in BL cell lines. The large number of changes observed between IARC385 and GM06990 also indicates an unexpectedly large variation between normal LCLs of different individuals. Interestingly, many changes in RFD profiles between BLs and and LCLs are associated with cell-type specific gene expression and differential binding of the Myc oncoprotein. Comparison of the two LMS profiles with all RFD profiles available in the laboratory reveals that they most resemble normal fibroblasts (IMR90). This suggests that the smooth muscle cancer cells might have undergone a fibroblastic transformation during tumorigenesis. Magnetic fields have been reported to perturb cellular processes such as cytoskeleton assembly. Sequencing of Okazaki fragments was used in a preliminary investigation of the possible effects of magnetic fields on DNA replication in yeast cells. No effect of magnetic fields on replication fork directionality were observed.