Développement et évaluation d'un micro-biocapteur électrochimique pour l'immuno-détection en temps réel de Legionella pneumophila dans les échantillons environnementaux

Development and evaluation of an electrochemical micro-biosensor for the immuno-detection in reel time of Legionella pneumophila in environmental samples

• Auteur / Autrice : Dejla Sboui
• Direction : Serge Riffard, Othmane Ali
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques, biotechnologie et santé
• Date : Soutenance le 21/10/2016
• Etablissement(s) : Lyon en cotutelle avec Université de Monastir (Tunisie)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Ingénierie Santé (Saint-Etienne)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement opérateur d'inscription : Université Jean Monnet (Saint-Étienne ; 1969-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Groupe sur l'immunité des muqueuses et agents pathogènes (Saint-Étienne)
• Jury : Président / Présidente : Ridha Mzoughi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Serge Riffard, Othmane Ali, Abderraouf Kenani, Nicole Jaffrezic-Renault, Najla Fourati-Ennouri
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Abderraouf Kenani, Nicole Jaffrezic-Renault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Monocouches moléculaires autoassemblées

Immunocapteurs

Anticorps monoclonaux

Legionella pneumophila

Mots clés libres

Legionella pneumophilia

Anticorps monoclonal

Immunocapteur

Monocouches mono-assemblées

Epoxysilane

Legionella pneumophilia

Monoclonal antibody

Immunosensor

Assembled Monolayers

Epoxysilane

Résumé

Legionella pneumophila peut causer une pneumonie fatale chez l’Homme dite maladie des légionnaires. L. pneumophila peut résister aux stress environnementaux en entrant dans un état VBNC (Viable mais non cultivable). La détection de L. pneumophila dans les milieux environnementaux est basée sur l’utilisation de méthodes normalisées : la culture (AFNOR T90-431, ISO 11731) et la PCR (AFNOR T90-471, ISO 12869). Mais, la culture ne détecte pas les formes VBNC et la PCR ne peut pas différencier les formes viables des mortes de la bactérie. Le premier objectif de notre étude était l’élaboration d’un immunocapteur pour la détection de L. pneumophila dans les échantillons artificiels. Notre immunocapteur a été obtenu par l’immobilisation d’un anticorps monoclonal anti-L. pneumophila (MAb) sur une électrode d’indium-tin oxyde (ITO), par la méthode de monocouches auto-assemblées d’époxysilane. Dans le second objectif, l’orientation des Mabs a été étudiée pour réduire la concentration à utiliser sans affecter sa sensibilité. Les Mabs ont été immobilisés sur l’ITO à l’aide des SAMs d’aminosilane pour la détection des formes VBNC. Les deux immunocapteurs ont été caractérisés par la mouillabilité (mesure de l’angle de contact), microscopie à force atomique (AFM), microscopie confocale à balayage laser (CLSM) et spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS). Une limite de détection de 10 bactéries a été déterminée dans les échantillons artificiels. La performance de l’immunocapteur ITO-APTES a été évaluée sur des échantillons réels. Les deux méthodes de l’électrochimie et la culture ont été comparées, et les résultats suggèrent une sensibilité plus élevée par la méthode électrochimique.

Legionella pneumophila, may cause a fatal pneumonia in humans named Legionnaires’ disease. The strategies of L. pneumophila to resist to stressful environmental conditions include the ability to enter into a VBNC (Viable But Not ulturable) state. Detection of L. pneumophila in environmental samples benefit from the use of standardized methods: culture (AFNOR T90-431, ISO 11731) and PCR (AFNOR T90-471, ISO 12869). Culture is hampered by its inability to detect VBNC forms. PCR cannot discriminate between live and dead bacteria. The first objective of our study was the elaboration of an immunosensor for the detection of L. pneumophila in artificial samples. Our immunosensor was obtained by immobilization of a onoclonal anti-L. pneumophila antibody (MAb), on an indium-tin oxide (ITO) electrode – by Self Assembled Monolayers (SAMs) method using an epoxysilane. In the second objective, orientation of antibodies was studied for redusing the concentration of MAb used without affecting its sensitivity. Anti-L. pneumophila antibodies were immobilized into an ITO electrode modified by SAMs of aminosilane for the detection of VBNC. Tow immunosensors elaborated were characterized by wettability (contact angle measurement), atomic force microscopy (AFM), confocal laser scanning microscopy (CLSM) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS). A detection limit of 10 bacteria was observed on artificial samples. The performance of the last immunosensor ITO-aminosilane electrode was evaluated in term of the bacteria detection in environmental samples. Electrochemical and culture methods were compared, and results suggest that the electochemical methods is more sensitive.