Étude de l'effet des microARN sur l'initiation de la traduction dirigée par l'IRES du Virus de l'Hépatite C

Study of microRNAs effect on the translation initiation directed by the Hepatitis C virus IRES

• Auteur / Autrice : Chloé Mengardi
• Direction : Théophile Ohlmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la Vie
• Date : Soutenance le 22/01/2016
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École normale supérieure de Lyon (Lyon ; 2010-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre international de recherche en infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Évelyne Manet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Théophile Ohlmann, Évelyne Manet, Sébastien Pfeffer, Hervé Seitz
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sébastien Pfeffer, Hervé Seitz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Site d'entrée interne des ribosomes

MicroARN

Virus de l'hépatite C

Mots clés libres

Virus de l'hépatite C

MicroARN

Site d'entrée interne des ribosomes

Initiation de la traduction

Traduction

Argonaute

PABP

EIF3

Facteur d’initiation

Régulation des gènes

Hepatitis C virus

MicroRNA

IRES – Internal Ribosome Entry Site

Protein translational initiation

Translation

Argonaute

PABP

EIF3

Initiation factor

Résumé

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui contrôlent l’expression génique, en s’hybridant, le plus souvent, de manière imparfaite à des séquences spécifiques qui se trouvent généralement dans la région non traduite en 3' (3’UTR) de transcrits cibles. Les miARN guident sur l’ARN messager (ARNm) un complexe protéique appelé RNA-induced Silencing Complex (RISC), composé des protéines Argonaute et TNRC6, qui perturbe l’initiation de la traduction et provoque la déadénylation et la dégradation du transcrit. C'est l’interaction entre le RISC et le complexe de pré-initiation de la traduction 43S (composé de la petite sous-unité ribosomique 40S et des facteurs d’initiation associés) qui entraîne la répression traductionnelle de l’ARNm ciblé. Des résultats récents ont démontré que le RISC perturbe le balayage de la région non traduite en 5’ (5’UTR) par le ribosome, étape qui requiert la présence de 2 facteurs d’initiation qui sont eIF4F qui reconnaît et lie la coiffe ainsi que la protéine PABP, fixée le long de la queue poly(A). Toutefois, les miARN peuvent également induire la stimulation de la traduction des transcrits cibles dans les cellules quiescentes, dans un lysat d’embryons de drosophiles ou encore dans les ovocytes de Xénope. Le mécanisme moléculaire de stimulation de l’expression par les miARN est encore mal connu mais requiert l’absence de queue poly(A) en 3’ des ARN cible et de TNRC6 au sein du complexe RISC. Le Virus de l’Hépatite C (VHC) possède en 5’ de son ARNg un site d’entrée interne du ribosome (IRES) qui recrute la petite sous-unité ribosomique 40S, sans nécessiter la reconnaissance de la coiffe par eIF4F, ni la protéine PABP, ni le balayage de la 5’UTR par le ribosome. Ces caractéristiques singulières nous ont conduits à rechercher l'impact du complexe RISC fixé en 3’ de l’ARNm sur l’initiation de la traduction du VHC. Pour cela, nous avons utilisé des transcrits contenant l'IRES du VHC en 5' et des sites d’hybridation du miARN let-7 en 3’. Ces ARNm ont ensuite été transfectés dans des lignées cellulaires hépatocytaires, ou non. A notre grande surprise, nous avons observé que la fixation du miARN let-7 sur la région 3' du transcrit stimulait fortement l’expression dirigée par l’IRES de VHC. Toutefois, l’augmentation de l’expression n’est pas due à la stabilisation du transcrit mais bien à une hausse significative de la synthèse protéique indépendamment d’un quelconque effet de miR-122. En utilisant d’autres IRES dites 'HCV-like', nous avons pu confirmer ces résultats et démontrer que, l’ajout d’une queue poly(A) en 3’ du transcrit, capable de fixer la PABP, annule cet effet stimulateur suggérant que l’absence de cette protéine est nécessaire pour que le complexe RISC stimule la traduction du VHC.

MicroRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs which control gene expression by recognizing and hybridizing to a specific sequence generally located in the 3’UTR of targeted messenger RNA (mRNA). miRNAs serve as a guide for the RNA-Induced Silencing Complex (RISC) that is composed by, at least, the Argonaute proteins and TNRC6. Recent studies have suggested that translation inhibition occurs first and is then followed by deadenylation and degradation of the targeted transcript. The miRNA-induced inhibition of protein synthesis occurs at the level of translation initiation during the ribosomal scanning step and it requires the presence of both the initiation factor eIF4G and the poly(A) Binding Protein (PABP). In this process, the RISC interacts with both PABP and 43S pre-initiation complex (composed by initiation factors and ribosome) and it results in the disruption of linear scanning of the ribosome along the 5’ Untranslated Region (5’UTR). In some specific cases, the binding of miRNAs to their target sequences can upregulate translation initiation. This has notably been demonstrated in G0 quiescent cells, drosophila embryos and Xenopus oocytes. Although the molecular mechanism by which upregulation occurs remains to be precisely determined, it appears that the absence of a poly(A) tail and the lack of availability of the TNRC6 proteins are amongst the major determinants. In the particular case of the Hepatitis C Virus (HCV), the genomic RNA is uncapped and non polyadenylated and harbors an Internal Ribosome Entry Site (IRES) which directly binds to the ribosome with no need for cap-recognition, PABP binding and ribosome scanning. These peculiar features of the HCV IRES prompted us to investigate how viral translation can be regulated by the miRNA machinery. In order to do that, we have used a mRNA that contains the HCV IRES in 5’ and 4 let-7 binding sites in its 3’ extremity. To most of our surprise, we have observed a strong stimulation of the expression of the HCV IRES when the construct is bearing the let-7 sites. This effect is not due to any interference with the miR-122 binding sites although the magnitude of stimulation reached the same level. Our data show that it is the presence of the RISC on the 3' end of the transcript that can stimulate internal ribosome entry at the 5' end. By using other HCV-like IRESes, we could confirm these data and further showed that the absence of a poly(A) tail was an absolute requirement for the stimulation to occur. These effects are not due to an increase of mRNA stability and are rather exerted at the level of translation.