Expression of recombinant olive lyase hydroperoxide in Escherichia coli and Pichia pastoris yeast Study of structure-function relationships of the enzyme
Expression de l’hydroperoxyde lyase recombinante d’olive chez la bactérie Escherichia coli et chez la levure Pichia pastoris Etude des relations structure-fonction de l’enzyme
Résumé
Hydroperoxide lyase (HPL) is an enzyme found in higher plants and involved in the lipoxygenase pathway. HPL acts on the 9- and/or 13-hydroperoxy fatty acids to produce C6 or C9 aldehydes, responsible for the fresh odor of cut grass known as "green note" and widely used by cosmetic and food industries. Production systems using recombinant enzymes are developed to meet the growing demand for natural green leaf volatiles. Thus, HPL from olive fruit (HPLwt) and the enzyme with its chloroplast transit peptide deleted (HPLdel), were cloned in the laboratory and expressed in Escherichia coli. Both recombinant enzymes were purified and biochemically characterized. They act only on 13-hydroperoxides, exhibit maximum activity at pH 7.5 and 25°C, and are more effective on the 13-hydroperoxy linoleic acid. The study of HPLwt and HPLdel stability over time has shown that all of the enzymatic activity is retained during a five weeks storage at -80°C in the presence of 10% glycerol. Furthermore, the addition of chemical compounds such as NaCl, Na2SO4 and glycine have increased the activity of both enzymes. Meanwhile, recombinant HPLs have been expressed in the eukaryotic system Pichia pastoris yeast. The HPLs are not secreted into the culture medium, but are expressed intracellularly, with a maximum after 24h of induction. Moreover, HPL structure-function relations were studied. The olive 13-HPL three dimensional structure has been built by computational modelling. Amino acids potentially involved in regiospecificity of the enzyme have been identified and modified by site-directed mutagenesis. Thus, T302K mutant has a catalytic efficiency on 13-hydroperoxides similar to the HPLwt, but it is also active on the 9-hydroperoxide of linoleic acid.
L’hydroperoxyde lyase (HPL) est une enzyme présente chez les végétaux supérieurs et impliquée dans la voie de la lipoxygénase. Elle agit sur les 9- et/ou les 13-hydroperoxydes d’acide gras pour produire des aldéhydes à 6 ou 9 carbones, responsables de l’odeur fraîche de l’herbe coupée dite « note verte », et très utilisés par les industries cosmétiques et agroalimentaires. Afin de répondre à la demande croissante en molécules à note verte naturelles, des systèmes de production utilisant des enzymes recombinantes sont développés. Ainsi, l’HPL d’olive (HPLwt) et l’enzyme dépourvue de son peptide de transit chloroplastique (HPLdel), ont été clonées au laboratoire et exprimées chez Escherichia coli. Les deux enzymes recombinantes ont été purifiées puis caractérisées biochimiquement. Elles sont spécifiques des 13-hydroperoxydes, présentent une activité maximale à pH 7,5 et à 25°C, et agissent plus efficacement sur le 13-hydroperoxyde d’acide linolénique. L’étude de la stabilité de l’HPLwt et de l’HPLdel au cours du temps a montré que la totalité de l’activité enzymatique est conservée durant cinq semaines de stockage à -80°C en présence de glycérol 10%. De plus, l’ajout de composés chimiques tels que le NaCl, le Na2SO4 et la glycine ont permis d’augmenter l’activité des deux enzymes. Parallèlement, les HPL recombinantes ont été exprimées dans un système eucaryote, la levure Pichia pastoris. Les enzymes ne sont pas sécrétées dans le milieu de culture, mais exprimées au niveau intracellulaire, avec une activité maximale obtenue après 24h d’induction. Par ailleurs, les relations structure-fonction de l’HPL ont été étudiées. La structure tridimensionnelle de la 13-HPL d’olive a été modélisée grâce à des méthodes computationnelles. Des acides aminés potentiellement impliqués dans la régiospécificité de l’enzyme ont été ciblés, puis modifiés par mutagénèse dirigée. Ainsi, le mutant T302K présente une efficacité catalytique sur les 13-hydroperoxydes similaire à celle de l’HPLwt, mais il est également actif sur le 9-hydroperoxyde d’acide linolénique.
Origine : Version validée par le jury (STAR)