Identification des ligands à ARN virales et des partenaires protéiques des récepteurs de type Rig-I pendant une infection active par des virus à polarité positive et négative

Identification of the viral RNA ligands and host protein partners of the Rig-I Like Receptors in an active infection by viruses of positive and negative polarity

• Auteur / Autrice : Raul Yusef Sanchez David
• Direction : Frédéric Tangy
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie
• Date : Soutenance en 2015
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : autre partenaire : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spectrométrie de masse

Rougeole

Chikungunya

Inflammation

Récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires

Molécules contenant des motifs associés aux pathogènes

Séquençage nucléotidique à haut débit

Mots clés libres

Rig-I like receptors

Résumé

Les infections virales peuvent avoir des conséquences dévastatrices pour l'hôte et doivent donc être contrôlés rapidement et efficacement par l'immunité innée antivirale. Les récepteurs de type Rig-I-like (RLR: Rig-I, MDA5 et LGP2) sont en première ligne de la course de l'évolution entre les virus et le système immunitaire de l'hôte. Ils jouent un rôle majeur dans la détection des infections par les virus à ARN pour initier et moduler l'immunité antivirale. Lors de la liaison de l'ARN, les RLR déclenchent une cascade de signalisation en aval résultant dans l'expression des interférons de type I, de cytokines pro-inflammatoires et d'un ensemble diversifié de gènes antiviraux. Une décennie après leur découverte, la cascade de signalisation impliquée dans la réponse RLR est bien connue, cependant, les mécanismes moléculaires qui conduisent à leur activation ont encore besoin d'être éclaircis. En effet, à l'intérieur d'une cellule infectée, les RLR interagissent avec des ARNs viraux, mais aussi avec des partenaires protéiques cellulaires. La plupart d'entre eux sont encore méconnus. Ainsi des stratégies novatrices sont nécessaires pour identifier les réseaux spatio-temporels d'interactions moléculaires des RLR à l'intérieur des cellules infectées. Afin d'éclaircir la nature des agonistes et des partenaires protéiques des RLR lors d'une infection virale, nous avons généré un ensemble de lignées cellulaires stables exprimant Rig-I, MDA5 et LGP2 marqués. Des approches biochimiques modernes basées sur la purification par chromatographie d'affinité des RLR suivie du séquençage à haut débit des ARNs co-purifiés, et l'analyse par spectrométrie de masse des complexes protéiques co-précipités, ont été utilisées. Comme une preuve de concept, un virus à ARN de polarité négative (virus de la rougeole, MV) et un virus de polarité positive (virus du chikungunya, CHIKV) ont été choisis. Nous avons obtenu une liste exhaustive d'interactions spécifiques virus-hôte des RLRs. Les analyses de séquençage ont révélé que des régions distinctes des génomes de MV et CHIKV sont spécifiquement reconnues. Nos résultats suggèrent que lors de l'infection MV, Rig-I reconnaît les génomes défectifs lorsque la souche virale utilisée en produit. Par contre, MDA5 et LGP2 s'associent spécifiquement avec des ARN provenant de la région codant le gène de la nucléoprotéine. Lors de l'infection CHIKV, seulement Rig-I s'associe spécifiquement à la région 3 'du génome viral. Par notre approche protéomique, nous avons établi trois listes abondantes de protéines cellulaires interagissant directement ou indirectement avec chacun des trois RLRs. Ces interactions protéine-protéine sont hautement spécifiques à la fois des RLR et des conditions. En outre plusieurs partenaires des RLR décrits précédemment ont été retrouvés dans nos listes de protéines. À notre connaissance, cette étude fournit la première visualisation simultanée des agonistes ARN et des partenaires protéiques des trois RLRs dans des cellules vivantes et en présence d'infection par différents virus à ARN.

Virus infections can have deVastating consequences for the host and must therefore be controlled rapidly and effectively by antiviral innate immunity. The Rig-I-like receptors (RLRs: Rig-I, MDA5 and LGP2) are at the frontline of the evolutionary race between viruses and the host immune system. They play a major role in sensing RNA virus infection to initiate and modulate antiviral immunity. Upon RNA binding, RLRs trigger a downstream signalling cascade resulting in the expression of type-I interferons, proinflammatory cytokines and a diverse set of antiviral genes. One decade after RLRs discovery, much is known on the signalling cascade involved in their response, however molecular mechanisms that lead to RLRs activation still need further elucidation. Indeed, inside an infected tell RLRs interact with particular signatures of viral RNA but also with cellular protein partners, most of them being still unknown. Thus, innovative strategies are needed to obtain spatiotemporal networks of macromolecular interactions involving RLRs inside infected tells. In order to shed light on RNA and protein partners of RLRs in physiological conditions during an active viral infection, we generated a set of stable tell fines expressing tagged Rig-I, MDA5 and LGP2 proteins. Modern biochemical approaches based on affinity purification of tagged proteins, next-generation sequencing (NGS) of RNA molecules and mass spectrometry analysis (LC-MS/MS) of protein complexes were applied. As a proof of principle one negative-sense (measles virus, MV) and one positive-sense (chikungunya virus, CHIKV) viruses were chosen. We obtained an extensive list of specific virus-host interactions between RLRs and both protein and RNA molecules. NGS analysis fi revealed that distinct regions of the MV and CHIKV genomes were specifically recognized in an RLR-dependent manner. Our findings suggests that during MV infection, Rig-I recognizes defective interfering genomes only if the viral strain produces them, whereas MDA5 and LGP2 specifically associate with RNA species originating from the MV nucleoprotein coding region. During CHIKV infection, only Rig-I was found to bind specifically the 3' untranslated region of the viral genome. Using our proteomic approach we established three prosperous lists of cellular proteins interacting either directly or indirectly with each of the three RLRs. These protein-protein interactions were highly specific because they were RLR-specific and conditions-dependent. Additionally, several previously described specific RLR partners were present in our protein lists. To our knowledge this study provides the first simultaneous visualisation of specific RNA and protein partners for Rig-I, MDA5 and LGP2 in living tells in the presence of different RNA viruses.