Profils de transcription de gènes immunomodulateurs dans le thymus : rôle du gène AIRE (Autoimmune Regulator) dans leur régulation d'expression

• Auteur / Autrice : Breno Luiz Melo-Lima
• Direction : Philippe Moreau, Eduardo A. Donadi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Hématologie et oncologie
• Date : Soutenance en 2015
• Etablissement(s) : Sorbonne Paris Cité en cotutelle avec Universidade de São Paulo
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Autre partenaire : Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019)

Mots clés

Mots clés contrôlés

génétique

Facteurs de transcription

Régulation de l'expression des gènes

Antigènes d'histocompatibilité de classe I

métabolisme

immunologie

Thymus (glande)

Tolérance immunitaire

Résumé

La tolérance immunitaire met en jeu des mécanismes qui contrôlent notamment les réponses auto-immunes. La principale composante de la tolérance centrale est l'éducation des lymphocytes T par sélection négative des thymocytes, coordonnée par le gène AIRE (Autoimmune Regulator). AIRE est le régulateur majeur de la transcription de milliers d'antigènes spécifiques des différents tissus dans la médulla thymique, par un processus de « promiscuité d'expression génique », au cours de la sélection négative des thymocytes. Un défaut de l'expression de AIRE conduit à des manifestations auto-immunes graves. Parmi les principaux mécanismes conduisant à l'établissement de la tolérance périphérique, l'expression de gènes immunomodulateurs spécifiques est un point clé dans la régulation des réponses immunitaires périphériques. En particulier, les molécules CMH de classe I non classiques (CMH lb) murines (Qa-2, Qa-1,Qa-10) et humaines (HLA-E et HLA-G) sont impliquées dans l'inhibition des cellules immunocompétentes et la génération de cellules T régulatrices. Bien qu'elles soient exprimées dans le thymus, on connait peu sur leurs fonctions dans cet organe. Cette étude a examiné les profils d'expression des gènes immunomodulateurs AIRE, FOXP3 (facteur de transcription clé des lymphocytes T régulateurs), HLA-G, HLA-E, ILT2/ILT4 (récepteurs inhibiteurs), Qa-2, Qa-1 et Qa-10 au cours de l'induction de la tolérance centrale durant l'ontogénèse du thymus, mais aussi après immunisation virale (virus de la fièvre jaune - YFV17D) et après inoculation de cellules tumorales (adénocarcinome de poumon de souris BALB/c — LP-07) chez des souris C57BL/6 et BALB/c. Nous avons également étudié l'influence du gène AIRE dans la régulation de ces molécules, dans des lignées cellulaires humaines thymiques et tumorales. Les profils de transcription ont été obtenus par PCR quantitative. Des essais fonctionnels ont été réalisés par transfection transitoire des lignées cellulaires humaines avec des constructions plasmidiques contenant le gène AIRE suivie de l'évaluation de son impact sur l'expression des molécules immunomodulatrices. Il a été observé que lors de l'ontogénèse thymique, les gènes CMH lb sont fortement exprimés pendant l'éducation thymique, en particulier lors de la sélection positive et négative des thymocytes, et ce différemment selon les souches de souris. Des corrélations positives significatives ont été observées entre les gènes Qa-2, FOXP3 et AIRE. Nous avons montré que la vaccination virale induisait la modulation de l'expression des gènes immunomodulateurs dans le thymus, avec induction de la transcription de Qa-1 et Qa-2, et répression de l'expression de FOXP3 et AIRE. Des niveaux élevés de ces gènes ont été induits chez les souris C57BL/6 avec une moindre efficacité du contrôle de l'infection en comparaison avec les souris BALB/c. L'inoculation des cellules tumorales LP-07 a induit, dans le thymus, une expression de gènes immunomodulateurs dépendante de la souche de souris, exception faite de l'induction de l'expression de Qa-1 qui a été observée dans les deux souches. L'induction de l'expression de FOXP3 en périphérie et la formation d'une masse tumorale chez les souris BALB/c pourraient être indicateurs de facteurs de susceptibilité au développement tumoral dans cette souche. D'autre part, nous avons observé que la transfection du gène AIRE activait significativement (p<0,05) la transcription des gènes HLA-G, FOXP3 et ILT2/ILT4 dans les lignées de cellules épithéliales thymiques (LT-TEC2 et 4D6). Elle favorise aussi l'augmentation de l'expression intracellulaire de la molécule HLA-G dans les cellules 4D6. Des analyses in silico, ont permis d'identifier 8 sites putatifs de liaison d'AIRE au locus HLA-G, 4 étant situés à la région 5' promotrice. Les résultats de cette étude suggèrent que les gènes immunomodulateurs, notamment HLA-G, peuvent être régulés par le facteur AIRE dans le microenvironnement thymique. Ils mettent en lumière la relevance de l'expression des gènes CMH Ib dans le thymus au cours de la mise en place de la tolérance centrale pendant l'ontogénèse mais aussi dans le maintien de la fonction thymique après l'infection virale et l'inoculation tumorale. En outre, ils soulignent l'importance du fond génétique comme mécanisme actif dans la tolérance centrale et périphérique. Ces résultats sont inédits et appuient l'hypothèse que le gène AIRE, en plus de coordonner la tolérance centrale, pourrait aussi agir sur la tolérance périphérique via la modulation de l'expression des gènes immunomodulateurs étudiés.

Immune tolerance involves several mechanisms that control immune responses against self antigens. The main process of central tolerance is T lymphocyte educations by means of the -negative selection coordinated by the AIRE gene (Autoimmune regulator). Aire is the major regulator of the transcriptional expression of thousands of tissue-related antigens in the thymic medulla, by the phenomenon of promiscuous gene expression, during the negative selection of thymocytes. Failures in AIRE expression lead to serious autoimmune manifestations. Among the major mechanisms in peripheral tolerance, the expression of immunomodulatory genes is a key point on the regulation of immune responses in periphery. Notably, murine non-classical MHC class I molecules (Qa-2, Qa-1 and Qa-10) as well as the human (HLA-E and HLA-G) are involved on inhibition of immunocompetent cells and in generation of regulatory T cells. Although they are expressed in the thymus, little is known about the function of these molecules in this organ. This study investigated the transcriptional profiles of the immunomodulatory genes (AIRE, FOXP3, HLA-G, HLA-E, ILT2/ILT4, Qa-2, Qa-10) during the induction of central tolerance during thymus ontogeny, and also after viral immunization (yellow fever virus - YFV17D) and cancer (LP-07 tumor cells from Lung BALB/c adenocarcinoma) inoculation in C57BL/6 and BALB/c mice. Similarly, we investigated the influence of AIRE in the gene expression regulation of these molecules in human thymic and tumoral cell lines. The characterization of the transcriptional profiles was performed by quantitative PCR. Functional assays were performed by transient transfection of human cell lines with plasmid-based constructs containing the AIRE gene, followed by the evaluation of the effect of this gene on the expression of immunomodulatory molecules. During ontogeny of thymus, MHC Ib genes were highly expressed during thymic education events, mainly in periods related to the positive and negative selection of thymocytes, and was distinct between mouse strains. Positive correlations were observed between Qa-2, FOXP3 and AIRE genes. Viral immunization induced the modulation of immunomodulatory genes expression in the thymus, with up-regulation of Qa-1 and Qa-2 genes, and down-regulation of FOXP3 and AIRE genes. C57BL/6 mice expressed higher levels of these genes, and were less efficient in controlling viral infection compared to BALB/c. Tumor cells inoculation induced a strain-dependent expression of immunomodulatory genes in the thymus; however, the induction of Qa-1 expression was shared by both strains. The increased FOXP3 expression in the periphery and the appearance of tumor mass, observed only in BALB/c mice, may be indicative of tumor-specific susceptibility factors. The transfected AIRE gene induced the expression of HLA-G, FOXP3 and ILT2/ILT4 genes (P <0. 05, for each comparison), specifically in thymic epithelial cell lines (LT-TEC2 and 4D6). Also, AIRE increased intracellular expression of HLA-G molecules in 4D6 cells. Using an in silico approach, 8 putative binding sites for Aire were identified along the HLA-G gene, among them 4 sites are located at the promoter region. The results obtained in the present study suggest that immunomodulatory genes, notably HLA-G, are transcriptionally regulated by AIRE in the thymic microenvironment, and highlight the relevance of MHC lb genes expression in thymus, both during the establishment of central tolerance during thymus ontogeny, as well as for the maintenance of thymic function during viral infections and tumor development. Additionally, this work highlights the importance of the individual's genetic background as an active mechanism in central and peripheral tolerance events. The evidences showed in this study are original and contribute to the idea that AIRE, in addition of this main function coordinating the central tolerance process, could be related also to the control of peripheral tolerance actively influencing the expression of immunomodulatory genes in the periphery.