Souris fragilitas ossium : rôle des sphingolipides dans l'ostéochondrogenèse

Fragilitas ossium mice : role of sphingolipids in osteochondrogenesis

• Auteur / Autrice : Sandra Garoby-Salom
• Direction : Anne Nègre-Salvayre, Robert Salvayre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physiopathologie
• Date : Soutenance le 28/09/2015
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des Maladies Métaboliques et Cardiovasculaires (Toulouse ; 2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sphingolipides

Os -- Croissance

Maladies -- Modèles animaux

Mots clés libres

Souris fro/fro

Sphingomyélinase neutre de type 2

Osteogenesis imperfecta

Apoptose

Chondrogenèse

Fro/fro mice

Neutral sphingomyelinase type 2

Osteogenesis imperfecta

Apoptosis

Chondrogenesis

Résumé

Le phénotype Fragilitas ossium (''fro'') chez la souris est caractérisé par un nanisme, une mortalité néonatale élevée, une malformation néonatale des os longs, et une hypominéralisation de type Osteogenesis Imperfecta. Ce phénotype est associé à une mutation du gène smpd3 qui code pour la sphingomyélinase neutre de type 2 (nSMase2) qui dégrade la sphingomyéline et génère du céramide impliqué dans l'apoptose, la différenciation cellulaire, l'inflammation et l'autophagie. Le rôle des sphingolipides dans le développement osseux est peu connu. Le phénotype de la souris fro suggère un rôle pour les sphingolipides dans le développement osseux dans la période fœtale et néonatale. L'objectif de cette thèse a été d'étudier les mécanismes par lesquels la voie des sphingolipides (nSMase2 et céramide) intervient dans l'ostéochondrogenèse. Dans un premier temps, nous avons étudié les mécanismes impliqués dans l'apoptose des chondrocytes hypertrophiques (CH) nécessaire à la maturation de l'os endochondral et déficiente chez la souris fro. Dans un second temps, nous avons caractérisé le fait que la mutation de la nSMase2 induit une chondrodysplasie de type campomélique chez les souris fro. Dans la première partie de ce travail, nous montrons que la mutation de la nSMase2 ne protège pas les fibroblastes contre l'apoptose induite par les agents de stress, mais les protège de l'apoptose induite par la privation en nutriments. Cette résistance fait intervenir une surexpression de la hyaluronan synthase 2 (HAS2) et l'acide hyaluronique qui a un effet antiapoptotique. L'absence d'activation de la phosphatase PP2A (qui est activée par le céramide) et l'activation consécutive d'AKT seraient impliquées dans la surexpression de HAS2 et la résistance à l'apoptose dans un milieu pauvre en nutriments. Dans la deuxième partie, nous avons étudié le rôle de la nSMase2 dans la maturation des CH au cours de l'ossification endochondrale, qui est retardée chez la souris fro. Nos résultats montrent que le déficit de maturation des CH s'accompagne d'un déficit d'expression du VEGF et de MMP13, de même qu'un défaut d'apoptose, de vascularisation et de minéralisation. De plus, on note un déficit d'autophagie qui permet aux CH d'atteindre normalement leur stade de différenciation terminale. L'addition de C2 céramide à des cellules souches issues de souris fro restaure partiellement l'expression du VEGF et des marqueurs d'autophagie, alors que l'utilisation d'un inhibiteur de sphingomyélinase neutre, le GW4869, induit une diminution d'expression du VEGF et de MMP13. Le mécanisme impliquerait l'activation d'AKT et la surexpression d'HAS2. Dans la troisième partie de ce travail, nous montrons que le déficit en nSMase2 induit une déformation de type campomélique dans les tibias des souris fro, avec une diminution de l'expression de COL2A1 et d'ACAN ainsi qu'un défaut d'expression de la protéine SOX9 dans les pattes des souris fro nouveaux-nés, chez l'embryon âgé de 12 à 17 jours, et dans les chondrocytes en culture issus de souris fro. L'addition de GW4869 à des cellules souches normales ou à des préchondrocytes de la lignée ATDC5, reproduit le déficit en COL2A1 et ACAN lors de leur différenciation. L'ensemble de ces résultats confirme que la mutation de la nSMase2 génère une chondrodystrophie de type campomélique chez la souris fro. Ces résultats mettent l'accent sur le rôle essentiel des sphingolipides dans le développement de l'os enchondral. Sur un plan médical, ce travail a permis de caractériser une nouvelle forme de chondrodysplasie par mutation de nSMase2, qui pourra être recherchée dans une perspective de diagnostic chez l'humain avec à moyen terme, le développement de nouveaux axes thérapeutique pour le traitement de pathologies osseuses néonatales.

The ''fragilitas ossium'' (''fro'') phenotype in mice presents the characteristics of ''osteogenesis and dentinogenesis imperfecta'', with a dwarfism, neonatal bone deformation, growth retardation and hypomineralisation of long bones. This phenotype is associated with a mutation of the smpd3 gene encoding the neutral type 2 sphingomyelinase (nSMase2). The nSMase2 hydrolyzes sphingomyelin on the inner leaflet of the plasma membrane and generates ceramide, a bioactive sphingolipid mediator involved in growth arrest, differentiation, inflammation, autophagy and apoptosis. The role of sphingolipids in bone development is not clarified so far, but the fro mouse phenotype suggests a role for sphingolipids in fetal and neonatal bone development. The objectives of the thesis were to investigate the role of the sphingolipid pathway in osteochondrogenesis, particularly in the apoptosis of hypertrophic chondrocytes (HC) which is a necessary step allowing to reach the terminal HC differentiation state and the maturation of enchondral bone. Lastly, we show that nSMase2 mutation leads to a campomelic-like phenotype in fro mice. The first part of the thesis is focused on the role of nSMase2 in apoptosis. We report that nSMase2 mutation does not protect fibroblasts against apoptosis evoked by stress-inducing agents, but is protective against apoptosis induced by nutrient deprivation. The resistance of nSMase2-mutant cells involves an overexpression of the hyaluronan synthase 2 (HAS2) and the presence of hyaluronic acid which is antiapoptotic in this system. The lack of activation of the PP2A phosphatase (which is activated by ceramide) and the subsequent activation of Akt are involved in the overexpression of HAS2 and the resistance of fro mice fibroblasts to apoptosis evoked by nutrient deprivation. In a second part, we have investigated the role of nSMase2 in the terminal HC differentiation which is delayed in fro mice. Our data indicate that the delay is associated with a decreased expression of VEGF and bone vascularisation, decreased Runx2 and MMP13 expression, and decreased apoptosis and mineralization patterns in fro mice limbs. Moreover, autophagy, a necessary step for the terminal differentiation state, is missing in fro HC. The addition of C2 ceramide to stem cells isolated from fro mice bone marrow restores in part the expression of VEGF, MMP13 and autophagy patterns. Conversely, the use of an inhibitor of nSMase, GW4869, in pre-chondrocytes C3H10T1/2 cells, results in a decreased expression of VEGF and MMP13, which confirms the role of nSMase2 in the delayed HC maturation in fro mice. This mechanism could involve Akt activation and HAS2 overexpression. In the last part of this work, we report that limb deformation evoked by nSMase2 mutation is ''campomelic-like'', as assessed by the tibia bowing associated with a decreased expression of COL2A1, ACAN and SOX9 in limbs from newborn fro mice and embryos from 12 to 17 days old. These data are confirmed in stem cells isolated from fro mice bone marrow and differentiated into chondrocytes or on cultured chondrocytes issued from fro mice legs. The addition of GW4869 to stem cells from control mice or to the ATDC5 prechondrocytic cell line, results in decreased COL2A1 and ACAN expression during chondrocyte differentiation. Taken together, these data indicate that nSMase2 mutation in mouse results in a campomelic-like chondrodystrophy with delayed HC maturation resulting in a defect in vascularisation and mineralization. These results emphasize the essential role of sphingolipids in the development of enchondral bone. From a medical aspect, this work allows to characterize a new kind of ''campomelic-like'' chondrodysplasia due to nSMase2 mutation, which could be explored in a perspective of medical diagnosis in humans, as well as the development of new therapeutic approaches using sphingolipids, for the treatment of bone pathologies in newborns and beyond.