Etude des mécanismes moléculaires impliquant l'ADN polymérase Kappa dans le checkpoint de phase S

Molecular insights into the replication checkpoint to the DNA polymerase kappa

• Auteur / Autrice : Laura Pierini
• Direction : Marie-Jeanne Pillaire, Jean-Sébastien Hoffmann
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies, cancérologie
• Date : Soutenance le 28/09/2015
• Etablissement(s) : Toulouse 3
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie Santé Biotechnologies (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (2011-....)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcriptase inverse

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Instabilité génétique

Réplication

Checkpoint de phase S

ADN polymérase Kappa

Ubiquitination

Chk1

Instability genetic

S-phase Checkpoint

Replication

DNA polymerase Kappa

Ubiquitination

Chk1

Résumé

La réplication de l'ADN est un évènement majeur pour la cellule car elle permet la duplication fidèle du matériel génétique. Il s'agit d'une étape critique du cycle cellulaire, car les fourches de réplication rencontrent fréquemment des barrières naturelles ou des lésions d'origine endogènes (lésions oxydatives) ou exogènes (agents physiques ou chimiques), sources de cassures chromosomiques et donc d'instabilité génétique. Une des réponses à ces fourches bloquées est l'activation du point de contrôle (checkpoint) de la phase S du cycle cellulaire. Nous avons montré que l'ADN polymérase Kappa (pol Kappa), polymérase dite translesionnelle en raison de ses capacité à franchir des lésions sur l'ADN, s'avère être aussi un acteur du point de contrôle de phase S. En effet, la déplétion de pol Kappa par ARN interférence dans différentes lignées cellulaires ou par immunodépletion d'un extrait de Xénope, entraîne un défaut de phosphorylation de Chk1. Pol Kappa est impliquée dans la synthèse de brins naissant d'ADN au niveau des fourches bloquées, ce qui facilite le recrutement du complexe 9-1-1 composé des protéines Rad9, Rad1 et Hus1et permet alors, une activation correcte du checkpoint de phase S. Afin de décrypter le rôle de pol kappa, nous avons construits différents mutants et nous avons analysé leur capacité à former des foyers, à être recrutés à la chromatine et à interagir avec différents partenaires dans des conditions d'activation du point de contrôle de phase S. Nous avons pu constater que le mutant du domaine d'interaction à PCNA était incapable de former des foci foyers ?. Nous avons ensuite observé, qu'en condition de stress réplicatif, pol Kappa était recruté à la chromatine grâce à son domaine d'interaction à PCNA et par différentes approches biochimiques, nous avons pu voir que pol kappa interagissait avec Rad9 et Chk1. Nous avons également mis en évidence que le défaut d'activation de Chk1 en l'absence de pol kappa reflétait d'une diminution de son taux dans le noyau, suggérant une régulation commune entre Chk1 et pol Kappa. En effet, nous avons observé que pol Kappa, comme Chk1, était régulés par l'ubiquitine hydrolase USP7. En effet, l'interaction entre pol Kappa et USP7 est augmentée en condition de stress. Nous avons pu voir, qu'à l'instar de Chk1, l'absence de USP7 entrainait une baisse du niveau de pol kappa dans le noyau. Ainsi nous proposons qu'en réponse à un stress réplicatif, pol Kappa et Chk1 soient stabilisés via leur dé-ubiquitination par USP7, permettant leur recrutement à la chromatine et une activation correcte du checkpoint de phase S. Parallèlement à ces travaux, des publications récentes montrent une implication possible de pol Kappa au niveau des séquences répétées. Nous avons pu mettre en évidence une interaction entre pol Kappa et Cenpb, protéine centromérique reconnaissant une séquence de 17 paires de bases dans l'ADN a-satellite. Ces résultats préliminaires suggèrent que le rôle de pol Kappa dans le checkpoint de phase S s'adresse notamment aux régions d'hétérochromatine. L'ensemble des résultats obtenus montre l'importance de pol Kappa dans le maintien de la stabilité génomique, par son rôle dans le checkpoint de phase S, et par son implication dans la régulation de Chk1 en condition de stress réplicatif.

DNA replication is a major event for cells which allow the faithful duplication of genetic material. It is a critical step of cell cycle, because replication forks encounters frequently naturals barriers (non B-DNA structures), exogenous barriers (chemicals agents), or endogenous barriers (oxydatives lesions). These different barriers can be at the origin of chromosomes breaks and lead to genetic instability. To overcome the stalled forks, cells have evolved two major mechanisms: the induction of ATR replication checkpoint pathway and the recruitment of specialized DNA polymerase to perform the translesion synthesis. This two pathways are essential to maintain genomic stability. Human DNA polymerase Kappa (pol Kappa), the most conserved specialized DNA polymerase, is best known to participate to translesion synthesis. Recently, we have shown that pol kappa has a crucial role in the S-phase checkpoint activation. Indeed, pol Kappa is implicated in the synthesis of short DNA intermediates at the stalled forks, facilitating the recruitment of 9-1-1 clamp, and is required for an optimal phosphorylation of Chk1, the main effector of the S-phase checkpoint. Durant my PhD thesis, I explored the molecular mechanisms underlying this newly identified role. We have constructed several pol kappa mutants, and we have observed that for the mutation in the PCNA binding domain impeded pol kappa to form foci in response to replication stress. We also showed the requirement of this domain for pol Kappa recruitment on chromatin. By different experimental approaches, we have described a complex in which pol Kappa interacts with Rad9 and Chk1, two proteins required for the S-phase checkpoint activation. The Chk1 phosphorylation defect observed in absence of Kappa could also be the consequence of the Chk1 protein level decreased in the nucleus, meaning a potential common regulation between pol Kappa and Chk1. Based on this observation, we have studied how pol Kappa is regulated upon a replication stress and like Chk1, pol Kappa seems to be regulated by ubiquitination. We focused our attention on USP7 an ubiquitin hydrolase known to regulate Chk1. We have demonstrated an interaction between pol Kappa and USP7, which is stimulated after replication stress. Moreover, USP7 depletion leads to a decrease of pol Kappa level in the nucleus, suggesting that de-ubiquination of pol Kappa could to be a prerequisite for its checkpoint function and its stability.