Thèse soutenue

Sondes moléculaires multifonctionnelles pour l'imagerie de fluorecence de membranes cellulaires
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Auteur / Autrice : Rémy Kreder
Direction : Andrey Klymchenko
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie biologique
Date : Soutenance le 06/03/2015
Etablissement(s) : Strasbourg
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Strasbourg ; 2000-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biophotonique et pharmacologie (Strasbourg)
Jury : Président / Présidente : Alain Wagner
Rapporteurs / Rapporteuses : Alain Burger, Anthony Romieu

Résumé

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Conçues à partir d’une approche rationnelle, nous avons créé de nouvelles sondes membranaires permettant l’imagerie de l’organisation de la membrane plasmique cellulaire. Dans ce travail, nous avons d’abord développé un groupe d’outils, à partir du fluorophore solvatochrome Nile Red et de Black Hole Quencher-2, capable de marquer spécifiquement les domaines ordonnés et désordonnés (radeaux) en les identifiant par leur couleur d’émission. Les études cellulaires, à l’aide de ces sondes, suggèrent que la membrane plasmique est composée de deux phases distinctes. Puis dans le but de créer de nouvelles sondes basées sur Nile Red compatibles avec le sérum et fixables par formaldéhyde/glutaraldéhyde, nous avons modifié la sonde, préalablement développée, NR12S avec un groupement PEG ou amino, respectivement. Etonnamment, la sonde PEGylée est rapidement internalisée dans la cellule et le dérivé animo agrège avec l’agent fixant. D’un autre côté,basée sur Nile Red, nous avons conçu une sonde capable de détecter un récepteur donné et de visualiser son environnement lipidique. Initialement, nous avons obtenu des sondes capables d’allumer leur fluorescence en se liant sur le RCPG à l’ocytocine. Puis, nous avons conjugué NR12Spar l’intermédiaire d’un espaceur PEG(12) au ligand de l’intégrine, RGD. Les résultats préliminaires montrent que la molécule peut se lier à la membrane et détecter l’ordre lipidique, cependant les études cellulaires nécessitent un achèvement. Nous avons aussi travaillé sur des sondes membranaires fluorogéniques (turn-on) pour de l’imagerie multi-couleurs. Basées sur le fluorophore3-méthoxychromone, nous avons obtenu des sondes plus brillantes et plus photostables que la sonde développée originellement à partir de 3-hydroxychromone (F2N12S). Grâce à l’important déplacement de Stokes, elles permettent une imagerie de la membrane cellulaire avec une autofluorescence minimale dans la région spectrale bleue, compatible avec les marqueurs communs verts et rouges. Pour finir, basées sur le fluorophore squaraine, nous avons développé trois nouvelles sondes opérant dans la région rouge lointain, qui est particulièrement intéressante pour l’imagerie in vitro et in vivo. Ces sondes montrent une orientation parallèle avec la membrane lipidique, alors que les expériences cellulaires indiquent que seule la sonde avec deux ancres lipidiques est capable de marquer de façon stable la membrane plasmique. Ces sondes développées ici sont prévues pour être utilisées dans la recherche des radeaux lipidiques aussi bien que pour l’imagerie super-résolution et multi-couleurs de cellules vivantes.