Caractérisation de nouvelles voies régulant l’expression et l’activité des protéines Mcl-1 et PUMA

Characterization of New Regulatory Pathways for Mcl-1 and PUMA Expression and Activity

• Auteur / Autrice : Gorbatchev Ambroise
• Direction : Aimé Vazquez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 19/11/2015
• Etablissement(s) : Université Paris-Saclay (ComUE)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie : biologie-médecine-santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Interactions cellules souches-niches : physiologie, tumeurs et réparation tissulaire (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Paris-Sud (1970-2019)
• Jury : Président / Présidente : Joëlle Wiels
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Aimé Vazquez, Joëlle Wiels, Solange Desagher, Philippe Juin, Éric Solary, Christian Billard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Solange Desagher, Philippe Juin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines proto-oncogènes c-bcl-2

Tumeur de Burkitt

Apoptose

Mots clés libres

Apoptose

Famille Bcl-2

Cancer

Lymphome de Burkitt

Apoptosis

Bcl-2 family

Cancer

Burkitt's lymphoma

Résumé

Le cancer est un problème majeur de santé public, tuant chaque année plusieurs millions de personnes. L’inhibition de la mort cellulaire programmée, l’apoptose, est considérée comme l’un des paramètres principaux impliqués dans son initiation et son développement. La régulation de la voie intrinsèque (mitochondriale) de l’apoptose est régulée par la famille Bcl-2. Jusqu’à maintenant, on pensait que la protéine PUMA, une protéine pro-apoptotique, était principalement exprimée au niveau mitochondrial. Nous avons montré qu’à l’état basal, PUMA était exprimé au niveau du cytosol des lymphocytes B humains. Cependant, suite à un signal apoptotique, PUMA est capable de transloquer du cytosol à la mitochondrie, de façon indépendante des caspases mais dépendante de l’activation de la MAPKinase p38, permettant ainsi son interaction avec les protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 dont l’inhibition conduit à l’apoptose. Les protéines anti-apoptotiques, Mcl-1 notamment, sont souvent surexprimées dans les tumeurs. Mcl-1 est une protéine à courte demi-vie, rapidement dégradée par le protéasome. Cette dégradation dépend de son ubiquitination réalisée par des E3 ligases (E3). Quelques E3 et une déubiquitinase (DUB), hydrolysant les chaînes d’ubiquitine, régulant l’expression de Mcl-1 ont été décrites. Cependant, ces protéines sont soit très peu exprimées, soit leur inhibition n’a pas d’impact sur l’expression de Mcl-1 dans notre modèle. Nous avons donc entrepris de caractériser de nouvelles E3 et DUB régulant l’ubiquitination de Mcl-1. Après une immunoprécipitation de Mcl-1 dans nos cellules, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, nous avons identifié la DUB USP14. Lorsque son expression est diminuée, l’expression et la stabilité de Mcl-1 augmentent de façon sélective. Nos résultats pourraient contribuer à une approche à double-tranchant dans le traitement du cancer, en retirant les freins à l’apoptose via une diminution de l’expression de Mcl-1 d’une part et en l’activant via PUMA de l’autre.

Cancer is a major public health issue, killing millions of people worldwide each year. The inhibition of apoptosis, a programmed cell death, in its onset and development has been well documented, making it one of the hallmarks of cancer. The regulation of the intrinsic (mitochondrial) pathway of apoptosis is regulated by the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family. Up until now, PUMA, a pro-apoptotic protein, was thought to be mainly expressed at the mitochondria, based on experiments where it had been overexpressed. We showed that endogenous PUMA is mainly expressed in the cytosol of activated or resting B cells. However, upon apoptotic stress, PUMA was able to translocate from the cytosol to the mitochondria, in a caspase-independent but p38-dependent manner, allowing PUMA to bind and inhibit the anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Mcl-1, and thereby leading to cell death. The anti-apoptotic proteins, especially Mcl-1, are often overexpressed in tumors. Mcl-1 is a protein with a short half-life, degraded rapidly by the proteasome. This degradation is ubiquitin-dependent, requiring E3 ligases (E3). A handful of E3s and one deubiquitinase (DUB), that hydrolyses the ubiquitin chains, have been reported to regulate Mcl-1 expression. However, they were either very poorly expressed or their inhibition had no impact on Mcl-1 expression in our model. We thus undertook to characterize new E3s and DUBs mediating Mcl-1 ubiquitination. After an immunoprecipitation of Mcl-1 in our cells, followed by a mass spectrometry analysis, we identified the DUB USP14. When knockdown, Mcl-1 expression was selectively increased and its stability enhanced. Our results could help build “double-edge” therapies, removing the breaks on apoptosis on one hand via Mcl-1 downregulation while activating it on the other via PUMA translocation.