Maturation in vitro du tissu testiculaire prépubère frais et décongelé de souris

• Auteur / Autrice : Brahim Arkoun
• Direction : Nathalie Rives
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie de la reproduction
• Date : Soutenance en 2015
• Etablissement(s) : Rouen
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spermatozoïdes

Cellules germinales

Spermatogonies

Spermatogenèse

Testicule

Résumé

La survie du jeune garçon après un cancer a considérablement été améliorée durant es dernières années du fait de l’efficacité de la chimio- et radiothérapie contre les cellules tumorales. Cependant, ces thérapeutiques engendrent des effets néfastes sur les tissus sains, particulièrement sur le testicule, avec pour conséquence un risque de stérilité à l’âge adulte. La congélation du tissu testiculaire est un préalable indispensable pour préserver la fertilité du garçon ne produisant pas encore de spermatozoïdes. Le tissu testiculaire décongelé pourra par la suite être utilisé en maturation in vitro, évitant la réintroduction de cellules tumorales, en vue d’une restauration de la fertilité du patient. Ce travail de thèse a eu pour objectif d’optimiser les étapes cruciales de congélation-décongélation et d’améliorer les conditions de culture du tissu testiculaire prépubère de souris afin d’augmenter le rendement de la spermatogenèse in vitro. La culture organotypique sur membrane avec le rétinol à 10-6 M a montré un maintien de la prolifération des cellules intratubulaires et une initiation de la spermatogenèse similaires entre le tissu testiculaire frais et décongelé au 9ème jour de culture avec une phase de stabilisation de la température à -8°C. La cultu re organotypique sur gel d’agarose du tissu testiculaire prépubère frais de souris a mis en évidence que le rétinol améliore de manière plus efficace la production de spermatides mais également de spermatozoïdes par comparaison avec le milieu de base seul à 30 jours de culture. De plus, la phase de stabilisation de la température située à -9°C a per mis une meilleure préservation de l’intégrité structurelle et fonctionnelle des tissus décongelés avec une production de spermatides tardives flagellées à 30 jours de culture. Enfin, la mise en place d’une stratégie antioxydante a permis d’améliorer les conditions de congélation-décongélation et de culture in vitro. La vitamine E, et non le GSH, réduit la production d’espèce oxygénées réactives et induit une meilleure différenciation des spermatogonies souches en spermatides tardives flagellées à partir du tissu testiculaire prépubère décongelé de souris. Les stratégies de congélation-décongélation et de culture organotypique du tissu testiculaire prépubère de souris développées dans ce travail de thèse peuvent être proposées dans le cadre d’une application humaine en vue d’une préservation et d’une restauration de la fertilité du patient guéri mais devenu stérile.

The survival of young boy after cancer has considerably progressed in recent years due to the efficiency of chemo- and radiotherapy against the tumor cells. However, these treatments cause adverse effects on healthy tissues, particularly on the testis thus increasing the risk of sterility during adulthood. Freezing testicular tissue is a prerequisite for preserving fertility in pre-pubertal boys that do not produce sperm yet. Post-thaw testicular tissue could be used for in vitro maturation, preventing the reintroduction of the tumor cells, in order to restore fertility of the patient. The aim of this thesis was to refine the crucial freezing-thawing steps and to optimize the culture conditions of pre-pubertal mice testicular tissue in order to improve the course and the yield of in vitro spermatogenesis. The organotypic culture on membrane with retinol at 10-6 M showed similar maintenance of intra-tubular cell proliferation and initiation of spermatogenesis between fresh and frozen-thawed pre-pubertal mice testicular tissue at day 9 of culture using a soaking temperature at -8°C. The organotypic culture of fre sh pre-pubertal mice testicular tissue on agarose gel showed that retinol more efficiently improved the generation of spermatids but also spermatozoa when compared with the basal medium alone at day 30 of culture. In addition, the soaking temperature at -9°C allowed a better preservation of the structural and functional integrity of the frozen-thawed tissues associated with flagellated late spermatid generation at day 30 of culture. Finally, the development of an antioxidant strategy allowed an improvement of freezing-thawing and culture conditions. Vitamin E, but not GSH, decreased reactive oxygen species generation and enhanced spermatogonial stem cells differentiation into flagellated late spermatids from frozen-thawed pre-pubertal mice testicular tissue. The strategies of freezing-thawing and organotypic culture of pre-pubertal mice testicular tissue developed in this thesis could be proposed for a human application in order to preserve and to restore fertility of the cured patient but became sterile.