Imagerie cellulaire du stress métallique induit par le cadmium chez la micro-algue verte Chlamydomonas reinhardtii par techniques synchrotron µXRF / XAS et nanoSIMS

Cell imaging of the metallic stress induced by cadmium in the green micro-alga Chlamydomonas reinhardtii by synchrotron-based techniques (µXRF/XAS) and nanoSIMS

• Auteur / Autrice : Florent Penen
• Direction : Dirk Schaumloffel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie analytique et environnement
• Date : Soutenance le 17/12/2015
• Etablissement(s) : Pau
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale sciences exactes et leurs applications (Pau, Pyrénées Atlantiques ; 1995-)

Mots clés

Mots clés contrôlés

Spéciation (chimie)

Toxicologie

Cadmium

Chlamydomonas reinhardtii

Imagerie (technique)

Mots clés libres

Imagerie Cellulaire

Chlamydomonas reinhardtii

Cadmium

Localisation subcellulaire

Spéciation chimique

Toxicité

XAS

ΜXRF

NanoSIMS

TEM/X-EDS

Cell imaging

Chlamydomonas reinhardtii

Cadmium

Subcellular location

Chemical speciation

Toxicity

XAS

ΜXRF

NanoSIMS

TEM/X-EDS

Résumé

La micro-algue verte Chlamydomonas reinhardtii est considérée comme un modèle dans l’étude du stress métallique chez les organismes photosynthétiques. Les mécanismes de tolérance au stress induit par le cadmium ne sont pas encore clairement établis. Afin de déterminer ces mécanismes, la localisation subcellulaire et la spéciation chimique in situ du cadmium ont été déterminées chez trois souches de C. reinhardtii exposées au cadmium en condition mixotrophe (CO2 + Acétate) : (i) une souche de type sauvage (wt), (ii) la souche cell-wall less (cw15) qui est déficiente en paroi cellulaire, (iii) la souche pcs1 qui surexprime la phytochélatine synthase (PCS), enzyme ordinairement cytosolique, directement dans son chloroplaste. Pour ce faire, la toxicité du cadmium a été déterminée en mesurant la croissance ainsi que la teneur en chlorophylle et en amidon des micro-algues. Puis, la localisation du cadmium au niveau subcellulaire a été réalisée par trois techniques complémentaires (fractionnement subcellulaire, µXRF, TEM/X-EDS). La spéciation chimique in situ du cadmium a été effectuée par µXAS et XAS. Enfin, l’imagerie élémentaire et isotopique par nanoSIMS a permis de compléter les distributions élémentaires dans la cellule et de déterminer l’impact du cadmium sur les mécanismes d’assimilation du carbone. (i) Les résultats de ce travail montrent que la souche wt est la plus sensible au cadmium des trois avec une diminution de la croissance et de la teneur en chlorophylle. Lorsqu’elle ne présente pas ces signes de toxicité, le cadmium est séquestré dans l’ensemble de la cellule par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. Suite à l’exposition à de fortes concentrations en cadmium, le cadmium intracellulaire est lié majoritairement à des ligands carboxylés probablement induits par le stress oxydatif. De plus, la présence du cadmium dans le pyrénoïde bloque l’assimilation du carbone inorganique (CO2), au profit de l’assimilation du carbone organique (acétate), qui est stocké sous forme d’amidon. (ii) La surexpression de la PCS de la souche pcs1 provoque une production d’amidon importante autour du pyrénoïde et protège la chlorophylle du stress lié au cadmium. Bien que la synthèse de phytochélatines soit potentiellement élevée, la moitié du cadmium intracellulaire est séquestrée par les granules de polyphosphates et l’amidon. (iii) La souche cw15 est la plus tolérante des trois souches et n’accumule pas la totalité du cadmium disponible, contrairement aux cellules possédant une paroi cellulaire. Similairement au wt, le cadmium intracellulaire est séquestré majoritairement par des ligands thiolés et de façon mineure par les granules de polyphosphates. L’observation de granules de polyphosphates excrétées par les micro-algues permet l’hypothèse de l’excrétion du cadmium vacuolaire induisant un flux constant de cadmium à travers la cellule. En conclusion, la séquestration du cadmium via des ligands soufre, potentiellement par des polypeptides thiolés, est le mécanisme de tolérance majoritaire mis en place par C. reinhardtii. Néanmoins, la séquestration du cadmium par les granules de polyphosphates semble apporter une plus grande tolérance vis-à-vis du stress lié au cadmium.

The green micro-alga Chlamydomonas reinhardtii is commonly used as a model for the study of the metallic stress in photosynthetic organisms. Tolerance mechanisms against stress induced by cadmium are not well understood. In order to determine these mechanisms, subcellular location and in situ speciation have been determined in three C. reinhardtii strains exposed to cadmium in mixotrophic conditions (CO2 + Acetate) : (i) a wild type strain (wt), (ii) a cell-wall less strain (cw15) which is deficient in cell-wall, (iii) the pcs1 strain which overexpresses the cytosolic enzyme phytochetlatin synthase (PCS) directly in the chloroplast. Cadmium toxicity has been determined by the monitoring of growth and chlorophyll, starch content in micro-algae. Then, cadmium location at subcellular level has been performed using three complementary techniques (subcellular fractionation, µXRF and TEM/X-EDS). In situ cadmium speciation has been studied by µXAS and XAS. Finally, elemental and isotopic imaging by nanoSIMS has allowed to complete elemental distribution in the cells and to determine the impact of cadmium on the assimilation of carbon. (i) The results of this work show that the wt strain is the most sensitive strain to cadmium stress among the three studied strains with a growth and chlorophyll content decrease. When wt cells do not show signs of toxicity, cadmium is mainly sequestered in the whole cell by thiolated ligands and in polyphosphate granules. After an exposure to high concentration of cadmium, intracellular cadmium is mainly bound to carboxylated ligands, probably induced by oxidative stress. Moreover, cadmium located in the pyrenoid blocks inorganic carbon (CO2) assimilation and increases organic carbon (acetate) assimilation which is stored as starch. (ii) The overexpresssion of PCS in the pcs1 strain induces a strong production of starch around the pyrenoid and proctects the chlorophyll against cadmium stress. Although the synthesis of phytocheltins was potentially strong, half of the intracellular cadmium is sequestered in polyphosphate granules and in starch. (iii) Unlike cell-walled cells, the cw15 strain is the most tolerant strain and does not accumulate the totality of available cadmium. Similarly to wt strain, intracellular cadmium is mainly sequestered by thiolated ligands and in polyphosphate granules. The observation of polyphosphate granules excreted by the micro-algae allows the hypothesis of the excretion of vacuolar cadmium, inducing a constant flux of cadmium through the cells. In conclusion, cadmium sequestration by sulfur ligands, potentially by thiolated polypeptides, is the main tolerance mechanism implemented by C. renhardtii. However, cadmium sequestration in polyphosphate granules seems to allow a better tolerance against cadmium stress.