Thèse soutenue

Imagerie de transfert d’énergie par résonance de type Förster en utilisant du terbium pour l’évaluation des interactions protéine-protéine sur des membranes cellulaires

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Auteur / Autrice : Stina Linden
Direction : Niko Hildebrandt
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Physique
Date : Soutenance le 11/06/2015
Etablissement(s) : Paris 11
Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences et Technologies de l'Information, des Télécommunications et des Systèmes (Orsay, Essonne ; 2000-2015)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut d'électronique fondamentale (Orsay, Essonne ; 19..-2016)
Jury : Président / Présidente : Martin Oheim
Examinateurs / Examinatrices : Niko Hildebrandt, Martin Oheim, Raphaël Tripier, Rodolphe Jaffiol, Christien Merrifield
Rapporteur / Rapporteuse : Martin Oheim, Raphaël Tripier

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Cette thèse étudie l'utilisation de la microscopie FRET en décalage temporelle pour la détection de co-localisation des deux protéines membranaires E- et N-cadhérine. Ces protéines sont importantes pour les contacts cellule-cellule et jouent un rôle important dans la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), un processus clé dans la métastase du cancer. Dans EMT cellules perdent leurs marqueurs épithéliaux (par exemple E-cadhérine) et acquièrent des marqueurs mésenchymateuses (par exemple N-cadhérine), ce qui augmente leur motilité et le caractère invasif pour échapper à la tumeur primaire dans la circulation sanguine en tant que ce qu'on appelle des cellules tumorales circulantes (CTC). Ce manuscrit porte sur la détection des CTC qui ont subi une EMT partielle, montrant un phénotype hybride (épithélio-mésenchymateuse) et co-expriment E et N-cadhérine, par des études de co-localisation en utilisant le FRET sur une lignée modèle de cellules. FRET (Transfer d’énergie par résonance de type Förster) est un transfert d'énergie non-radiatif entre deux molécules qui sont en résonance et à proximité (environ 1-20 nm). Une co-localisation d’E- et N-cadhérine en clusters serait donc détectable par FRET. La coloration des cadhérines qui a été fait en utilisant des anticorps spécifiques marqués avec une donneur qui a un longue durée de vie de fluorescence, le complexe de terbium Lumi4-Tb (TbL4) de Lumiphore, Inc., et diverses accepteurs. La longue durée de vie du donneur et la longue durée de vie d’accepteur sensibilisé (FRET) pourraient être imagés dans une configuration de microscopie en décalage temporelle. L’imagerie en décalage temporelle présente plusieurs avantages par rapport à l'imagerie stationnaire en termes de suppression efficace du bruit de fond dans des échantillons biologiques. L'installation décrite dans ce manuscrit est basée sur l'utilisation d'une caméra CCD intensifiée, une source d'excitation laser pulsé en UV et un décalage temporel défini de quelques microsecondes entre l'excitation et l'acquisition d'image. L’imagerie de FRET en décalage temporelle a été utilisée pour étudier des différents échantillons biologiques (intracellulaire et située à la membrane). Bien que les deux marqueurs protéiques pourraient imager correctement sur les mêmes cellules, FRET entre E- et N-cadhérine ou E- et E-cadhérine ne pouvaient pas être détectés. Des expériences de contrôle avec des anticorps contre le même anticorps primaire ont révélé des signaux de FRET forts à cause de la reconnaissance des anticorps donneurs et accepteurs aux mêmes anticorps primaires. Ces résultats de FRET entre deux anticorps différents séparés par quelques nanomètres démontrent la faisabilité de mesurer des interactions protéine-protéine et la co-localisation sur des membranes à l'aide de l’imagerie de FRET en décalage temporelle en utilisant TbL4. Imagerie en décalage temporelle de quelques microsecondes est particulièrement intéressante pour l'enquête des interactions protéine-protéine dans des échantillons biologiques hautement autofluorescentes, tels que les tissus cancéreux.