Development of new analytical strategies for the molecular characterization of oxidation states at a proteomic scale
Développement de nouvelles stratégies analytiques pour la caractérisation moléculaire des états d'oxydation à l'échelle protéomique
Résumé
The analysis of protein Post-Translational Modifications (PTMs) is probably the most important contribution that proteomics can give to life sciences. Although separative techniques and mass spectrometry have improved tremendously, the quantitative analysis of PTMs remains an analytical challenge. The limited number of PTMs that can be robustly computed in a single research, the necessity of enrichment steps and performing quantitative estimations using only one peptide, are just the most evident difficulties faced. Furthermore, PTMs quantification should always be associated to protein expression levels to avoid false positives. We have developed new analysis methods allowing the quantification of PTM changes while taking into account protein expression levels. These strategies were applied to the study of cysteine oxidation within the contexts of oxidative stress and redox homeostasis. The first strategy, OcSILAC, is a revision of the biotin switch adapted to Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture; it was applied to the study of a thioredoxin reductase silenced yeast model. OcSILAC leads to important technical improvements and data analysis innovations. The results obtained are in agreement with the extensive existing literature concerning the yeast redox system. OcSILAC was then adapted to a subcellular fractionation kit to extend the coverage of the cysteine redoxome. A second strategy called OxiTMT was developed based on cysteine specific tandem mass tags. OxiTMT was used to study E. Coli cells exposed to oxidative treatment. OxiTMT offers the advantage of a wide range of applications that can extended to the study of tissues and biopsies.
L'analyse des modifications post-traductionnelles (PTMs) est une des contributions les plus importantes de la protéomique aux sciences du vivant. Malgré les progrès importants des techniques séparatives et de la spectrométrie de masse, la quantification des PTMs reste un défi analytique. Le nombre limité de PTMs identifiées robustement dans une recherche, la nécessité d'enrichissement et l'estimation quantitative basée sur un seul peptide ne représentent que les difficultés les plus évidentes. De plus, la quantification des PTMs doit toujours être associée au profil d'expression de la protéine pour éviter les faux positifs.Nous avons développé de nouvelles stratégies analytiques de quantification des PTMs, en prenant en compte le niveau d'expression des protéines. Ces stratégies ont été appliquées à l'étude de l'oxydation des cystéines dans le cadre du stress oxydatif et de l'homéostasie redox.La stratégie OcSILAC est une adaptation de la technique biotin switch au marquage métabolique des cultures cellulaires et a été appliquée à un modèle de levure n'exprimant pas la thiorédoxine réductase. OcSILAC apporte des améliorations techniques importantes et une innovation dans le traitement des données. Les résultats obtenus sont en accord avec le système redox de ce modèle. OcSILAC a ensuite été adaptée au fractionnement subcellulaire pour étendre la couverture du redoxome.Une deuxième stratégie, OxiTMT, a été développée en se basant sur des tandem mass tags spécifiques de la cystéine. OxiTMT a été employée à l'étude de cellules E. Coli soumises à un traitement oxydatif. OxiTMT offre l'avantage d'une large gamme d'applications qui peut s'étendre aux tissus et aux biopsies.
Origine : Version validée par le jury (STAR)