Cristallisation du transporteur ABC BmrA de Bacillus subtilis : développement d’une nouvelle méthode de dosage des détergents par Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)

Crystallization of BmrA, bacterial ABC transporter : development of a new detergents dosage assay by Matrix-Assited Laser Desorption Ionization (MALDI)

• Auteur / Autrice : Arnaud Kilburg
• Direction : Pierre Falson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance le 15/09/2015
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Patrice Gouet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Nushin Aghajari, Martin Picard
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Isabelle Mus-Veteau, Jean-Jacques Lacapère, James N. Sturgis

Mots clés

Mots clés contrôlés

Analyse

Détergents

Cristallisation

Protéines membranaires

Transporteurs ABC

Mots clés libres

Transporteurs ABC

Phénotype de résistance à de multiples drogues

Protéines membranaires

Cristallisation

Structure 3D

Dosage des détergents

Bacterial ABC transporter

Multiple-drug resistance phenotype

Membrane proteins

Crystallization

3D structure

Detergents dosage

Résumé

Notre projet vise à déterminer la structure 3D du transporteur BmrA de Bacillus subtilis. La protéine a été purifiée dans six détergents différents. L'utilisation de foscholine 12, a conduit à cristalliser OmpF, une porine de la membrane externe d'E. coli. Nous montrons que les conditions de cristallisation influencent directement l'empilement cristallin d'OmpF. Le protocole de purification de BmrA, optimisé en utilisant du triton X100 à l'extraction puis un mélange β-D-dodecyl maltoside-cholate pour les étapes chromatographiques nous a permis d'obtenir à 4°C des cristaux, pour lesquels nous avons vérifié qu'ils sont constitués de BmrA. Ces cristaux ont permis d'obtenir un jeu complet jusqu'à 7 Å. Ces données de diffraction constituent une avancée significative pour résoudre à court terme la structure 3D de BmrA. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage des détergents qui est basée sur la détermination par spectrométrie de masse de type MALDI du ratio d'isotopes deutérés/ protonés. La méthode a été validée avec la FC12, le DDM, le β-OG, le LMNG, le CHAPS, le cholate et des détergents calix[4]aréniques, en mesurant la concentration de ces détergents dans différentes conditions d'extraction/purification, de concentration, dialyse et gel filtration, de différentes protéines membranaires. Cette méthode nous a permis (i) d'estimer la taille de la ceinture de détergent associée à BmrA et d'autres protéines membranaires (ii) de moduler cette taille en fonction de mélange de détergents et (iii) d'apporter des informations sur le comportement des complexes protéine-détergent

Our project aims to determine the 3D structure of BmrA from Bacillus subtilis. The protein was purified in six different detergents. Using foscholine 12, led to crystallize OmpF, an outer membrane porin of E. coli. We show that the crystallization conditions directly influence the crystal packing of OmpF. The BmrA purification protocol optimized by using Triton X100 at the extraction and a mixture β-D-dodecyl-maltoside cholate for chromatographic steps allowed us to get to 4°C crystals, for which we verified they consist of BmrA. These crystals have yielded full data to 7 Å. These diffraction data are a significant advance in the short term to resolve the 3D structure of BmrA. We have developed a new detergents dosage assay which is based on the determination by MALDI-type mass ratio of deuterated isotopes / protonated. The method was validated with the FC12, the DDM, the β-OG, the LMNG, CHAPS, cholate detergents and calix [4] aréniques by measuring the concentration of these detergents in different conditions of extraction/ purification, concentration, dialysis and gel filtration, of different membrane proteins. This method allowed us (i) to estimate the size of the detergent belt associated to BmrA and other membrane proteins (ii) to modulate this size in terms of the detergent mixture and (iii) to provide information on the behavior of complex protein-detergent