Développement d'un système d'expression acellulaire à base d'extrait de germe de blé pour la production, la purification et la caractérisation structurale et fonctionnelle de protéines membranaires eucaryotes : application à la préparation des protéines du virus de l'hépatite C
Auteur / Autrice : | Marie-Laure Fogeron |
Direction : | François Penin, Anja Böckmann |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Biochimie |
Date : | Soutenance le 30/06/2015 |
Etablissement(s) : | Lyon 1 |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....) |
Partenaire(s) de recherche : | Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....) |
Jury : | Président / Présidente : Gilbert Deléage |
Examinateurs / Examinatrices : Jean-Michel Betton, François-Loïc Cosset | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Jean Dubuisson, Xavier Hanoulle |
Mots clés
Mots clés contrôlés
Résumé
Alors que 30% du génome code pour des protéines membranaires, moins de 3% des structures protéiques dans la Protein Data Bank correspondent à ces protéines. En raison de leur nature hydrophobe, les protéines membranaires sont en effet très difficiles à produire dans des systèmes d'expression classique en cellules, notamment en bactéries. L'étude structurale des protéines membranaires du virus de l'hépatite C (VHC) sous forme entière et native a donc été pendant longtemps entravée. Le VHC est un virus à ARN positif dont le complexe de réplication est basé sur un réarrangement spécifique des membranes induit par l'action concertée de plusieurs protéines non structurales du virus dont NS2, NS4B et NS5A. La structure tridimensionnelle et le rôle de ces protéines dans la réplication virale sont encore mal connus. Pour surmonter les limitations qui empêchent leurs études structurales et fonctionnelles, un système d'expression acellulaire à base d'extrait de germe de blé a été développé avec succès, permettant la production des protéines NS2, NS4B et NS5A entières directement sous une forme solubilisée en présence de détergent. Ces protéines membranaires sont produites et purifiées par chromatographie d'affinité dans des quantités de l'ordre du milligramme. Des analyses par filtration sur gel indiquent que les échantillons obtenus sont homogènes. De plus, des analyses structurales par dichroïsme circulaire montrent que les protéines produites dans ce système sont bien repliées. Leur reconstitution dans des lipides est en cours d'optimisation. Le but ultime est en effet de déterminer leur structure par RMN du solide dans un environnement lipidique mimant l'environnement natif