Production de Polyhydroxybutyrates à partir d'acides gras volatils en culture ouverte : influence du degré de limitation en phosphore sur les réponses cinétiques et les sélections microbiennes.

• Auteur / Autrice : Laetitia Cavaille
• Direction : Etienne Paul, Guillermina Hernandez-Raquet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génie des Procédés et de l'Environnement
• Date : Soutenance le 01/06/2015
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : Mécanique, Energétique, Génie Civil, Procédés
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés - Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés / LISBP
• Jury : Président / Présidente : Jean-Louis Uribelarrea
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Etienne Paul, Guillermina Hernandez-Raquet, Pierre Fontanille, Maria Albuquerque
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Maria Reis, Manfred Zinn

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polyhydroxyalcanoates

Microorganismes

Culture mixte (microbiologie)

Mots clés libres

PHB

Limitation P

Chemostat

Cultures mixtes

Sélection microbienne

PHB

P limitation

Chemostat

Mixed cultures

Microbial selection

Résumé

La production de biopolymères de type polyhydroxyalkanoates (PHA) est une alternative attractive pour remplacer, en partie, les plastiques produits à partir de ressources fossiles. Les contraintes techniques imposées par les cultures pures (substrat purifié, stérilité…) impliquent un coût de production qui rend la production de ces bioplastiques difficilement compétitive par rapport à celle des plastiques conventionnels. L’utilisation de cultures non axéniques permettrait de palier les contraintes des cultures pures mais nécessite une étape de sélection des microorganismes producteurs naturels de PHA. A partir d’un inoculum issu de boues d’épuration et de substrats de types AGV (acide butyrique et acétique), une stratégie de limitation de la croissance par le phosphore pour accumuler du PHB a été mise en place. Nous avons étudié, avec les modes de culture fed-batch et continu, le potentiel de sélection de souches productrices et de production de PHA en fonction des paramètres opératoires (taux de dilution) et environnementaux (degré de limitation en phosphore). L’objectif scientifique a consisté à améliorer les connaissances sur le rôle d’une limitation en phosphore selon les conditions opératoires du procédé, tout d’abord sur la nature des souches sélectionnées, et ensuite sur la croissance et l’accumulation de PHB. Pour cela, une démarche associant l’identification des micro-organismes en dynamique par une technique de pyroséquençage, une caractérisation cinétique des micro-organismes sélectionnés, une analyse procédé et le développement d’une modélisation cinétique a été effectué. L’objectif final du travail visait l’optimisation des procédés de production de PHB en culture non axénique : productivité, rendement, titre final en PHB mais aussi fiabilité et robustesse, en vue de définir une stratégie de production optimale de PHA. Les performances atteintes lors des cultures en fed-batch se situent parmi les meilleures de la littérature (70% de PHA) en cultures mixtes sans étape d’enrichissement préalable en microorganismes producteurs. Les résultats ont montré le rôle de la limitation phosphore sur le déclenchement de la production de PHB. En chémostat, l’analyse des paramètres macro-cinétiques, à partir des sélections microbiennes, a révélé des cinétiques de conversion du substrat carboné en PHB, biomasse catalytique et CO2 dépendantes du degré de limitation en phosphore et du taux de croissance. Le taux de phosphore intracellulaire (dépendant du taux de croissance et du degré de limitation phosphore), est le paramètre gouvernant la conversion du carbone. De plus, ce rôle a été observé pour toutes les populations sélectionnées sous limitation phosphore, démontrant un comportement universel de ces populations face à une limitation phosphore. En parallèle, des études dynamiques en batch à partir de ces populations ont permis de caractériser les paramètres cinétiques des souches, montrant une vitesse maximale de production de PHB de 0,6 et 1,2 Cmol/Cmol.h avec acide acétique et butyrique respectivement. Ces hypothèses réalisées à partir des observations expérimentales ont permis l’établissement d’un nouveau modèle cinétique basé sur le rôle du phosphore intracellulaire sur la conversion du carbone. La confrontation de ce modèle aux résultats expérimentaux a conforté et amélioré la compréhension des processus de dilution intracellulaire du phosphore et de stockage de PHB. Ce modèle a également permis d’explorer une large gamme de conditions environnementales et de prédire les comportements microbiens d’organismes producteurs et non producteurs. A partir des résultats observés et du modèle cinétique établi, les performances de différentes configurations de procédés de production de PHA ont pu être discutées : chémostat simple ou double étage, fed-batch, chémostat et batch... Les performances en termes de productivités, taux de PHB intracellulaires, degré de sélection de producteurs et robustesse du procédé sont comparées.

The production of polyhydroxyalkanoates (PHA) is an attractive alternative for plastics produced from fossil resources. The technical constraints imposed by pure cultures (purified substrate, sterilization ...) involve a high production cost of PHA production, and the production of these bioplastics is hardly competitive. The use of non-axenic cultures would avoid the constraints of pure cultures but requires a selection step of PHA producers. From a microbial inoculum (activated sludge) and AGV (butyric and acetic acid), a strategy for limiting the growth by phosphorus to accumulate PHB was established. From fed-batch and continuous culture, we studied the selection of PHA producers and the production of PHA based on operating parameters (dilution rate) and environmental (degree of phosphorus limitation). The scientific objective was to improve knowledge on the role of phosphorus limitation according to the operating conditions of the process, first about the nature of selected strains, and then about the cellular growth and PHB accumulation. For this, an approach involving identification of microorganisms by pyrosequencing method, a kinetic characterization of selected microorganisms, a process analysis and development of a kinetic modeling were performed. The ultimate goal of the work was the optimization of PHB production processes in non-axenic culture: productivity, yield, final PHB concentration but also reliability and robustness, to define an optimal production strategy of PHA. The performance achieved during the fed-batch cultures are among the best in the literature (70% PHA) in mixed cultures without enrichment step of PHA producers. The results showed the role of phosphorus limitation on the PHB production. Thus, it has been demonstrated the importance of degree of phosphorus limitation to maintain cell growth allowing enrichment in PHA producers explaining the high content of PHA obtained. From microbial selections in chemostat culture, the analysis of macro-kinetic parameters revealed conversion kinetics of the carbon substrate in PHB, catalytic biomass and CO2, dependent on the degree of phosphorus limitation and growth rate. The limits on the degree of plasticity of the intracellular phosphorus (ranging from 3.8% to 0.045%) were identified as a function of the specific growth rate. This intracellular phosphorus content (depending on the growth rate and degree of phosphorus limitation), is the parameter governing carbon conversion. Furthermore, this role of the intracellular phosphorus was observed for all populations selected under phosphorus limitation in this study, demonstrating a universal behavior of these populations face to phosphorus limitation. In parallel, dynamic studies in batch reactor from these selected populations were used to characterize the kinetic parameters of the strains, showing a maximum PHB production rate of 0.6 and 1.2 Cmol/Cmol.h with acetic acid and butyric respectively. These hypotheses made from experimental observations allowed the establishment of a new kinetic model based on the role of intracellular phosphorus on carbon conversion. The comparison of this model with experimental results has strengthened and improved the understanding of the mechanisms of intracellular phosphorus dilution and storage PHB. This model was also used to explore a wide range of environmental conditions and predict microbial behavior of PHA producers and non-producing organisms according to the operating conditions in continuous or batch reactor. From the results observed and the established kinetic model, the performance of PHA production processes of different configurations was discussed: chemostat single or two-stage, fed-batch, chemostat plus batch... The productivities, intracellular PHB content, performances of selection and the reliability of the process are compared.