Thèse soutenue

Etudes structurales et biochimiques de la γ-kétol réductase chloroplastique d'Arabidopsis thaliana : caractérisation d’une nouvelle classe de « Medium chain dehydrogenase/reductase » impliquée dans la détoxification.

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Auteur / Autrice : Sarah Mas y Mas
Direction : David Cobessi
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
Date : Soutenance le 30/10/2015
Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes (ComUE)
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
Jury : Président / Présidente : Christelle Breton
Examinateurs / Examinatrices : Nushin Aghajari, Norbert Rolland
Rapporteurs / Rapporteuses : Claudine Mayer, Frédérique Favier

Résumé

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Sous l'effet du stress oxydatif, la production des espèces réactives de l'oxygène (ERO) est accrue. Les ERO peuvent réagir avec différentes molécules biologiques dont les acides gras polyinsaturés libres ou provenant des lipides membranaires engendrant la formation d'hydroperoxydes d'acides gras. Dans le chloroplaste, ces molécules sont sujettes à de nombreuses modifications enzymatiques ou chimiques aboutissant à la formation d'oxylipines. Les oxylipines participent à la signalisation cellulaire (précurseurs de la voie du jasmonate par exemple), à la défense de la plante (activité antimicrobienne par exemple). Certaines de ces molécules très réactives et toxiques doivent être métabolisées en des produits moins réactifs, par des réactions d'oxydoréduction par exemple.La ceQORH (chloroplast envelope Quinone OxydoReductase Homolog) et IEP32 (Inner Envelope Protein 32) d'Arabidopsis thaliana sont des oxydoréductases chloroplastiques impliquées dans la détoxification de la plante. Elles sont transportées au travers de l'enveloppe du chloroplaste sans clivage de leur peptide de transit par une voie d'import alternative à la voie TOC/TIC (Translocon at the Outer envelope membrane of Chloroplasts et Translocon at the Inner envelope membrane of Chloroplasts). Ces particularités ont fait de la ceQORH et d'IEP32 des enzymes intéressantes à étudier.IEP32 a été purifiée et cristallisée. Les structures de la ceQORH sous forme apo, liée au NADPH et liée au NADP+ et à des inhibiteurs ont été déterminées en utilisant la cristallographie aux rayons X. Leur analyse a permis de mettre en évidence que la ceQORH existe sous différents états oligomériques dans les conditions expérimentales utilisées. Ces observations ont été confirmées par des expériences d'ultracentrifugation analytique. La ceQORH est une enzyme monomérique qui lie le NADPH par l'intermédiaire de son domaine de Rossmann . Le site catalytique, large et hydrophobe, permet à la ceQORH d'accommoder et de réduire un grand nombre de substrat dont le motif commun est la présence d'une fonction alcène en α, β d'un groupement carbonyle. Les constantes d'efficacité et d'affinité étant meilleures pour les γ-kétols que pour les quinones, nous proposons que la ceQORH soit renommée « γ-kétol réductase ».Mots clefs : chloroplaste - Medium chain dehydrogenase/reductase - γ-kétol réductase - oxylipines - oligomérisation - inhibition - cristallographie aux rayons X - ultracentrifugation analytique