Etude de la diversité structurale et fonctionnelle au sein de l'espèce Penicillium roqueforti

Study of the structural and functional diversity within Penicillium roqueforti species

• Auteur / Autrice : Guillaume Gillot
• Direction : Emmanuel Coton
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie-Santé.Microbiologie
• Date : Soutenance le 07/12/2015
• Etablissement(s) : Brest
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Santé, information-communication et mathématiques, matière (Brest, Finistère)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire universitaire de biodiversité et écologie microbienne
• Jury : Président / Présidente : Jérôme Mounier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Emmanuel Coton, Jérôme Mounier, Philippe Silar, Henry-Éric Spinnler, Tatiana Giraud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Silar, Henry-Éric Spinnler

Mots clés

Mots clés contrôlés

Fromage à pâte persillée

Penicillium roqueforti

Mots clés libres

P. roqueforti

Fromage

Diversité

Populations génétiques

Volatilome

Protéolyse

Mycotoxines

Acide mycophénolique

P. roqueforti

Cheese

Diversity

Genetic populations

Volatilome

Proteolysis

Mycotoxins

Mycophenolic acid

Résumé

Plusieurs espèces fongiques dites « technologiques » jouent un rôle primordial, via leurs activités métaboliques, dans le développement des caractéristiques organoleptiques et la typicité des fromages. Cependant, malgré une utilisation et une consommation ancestrale, un manque de connaissances persiste que ce soit aux niveaux génétique ou fonctionnel concernant certaines de ces espèces, notamment Penicillium roqueforti. Principalement utilisé dans la production de fromages à pâte persillée, c’est lors de l’affinage que P. roqueforti participe au développement des qualités organoleptiques typiques de ces fromages via, entre autres, ses activités lipolytiques et protéolytiques. Cette espèce est également caractérisée par une diversité morphologique importante, largement révélée au cours de ces travaux, et ayant donné lieu à certaines dénominations technologiques distinctes par le passé conduisant à une interrogation sur la possible existence de plusieurs espèces au sein de l’entité P. roqueforti. Dans ce contexte, une étude phylogénétique basée sur le principe de concordance généalogique (GC-PSR) a été menée sur une vaste collection mondiale de P. roqueforti en utilisant 8 loci. Cette étude a montré l’existence d’une espèce unique. La diversité intraspécifique des isolats de P. roqueforti a ensuite été évaluée en utilisant 4 marqueurs microsatellites qui ont permis de révéler l’existence de 28 haplotypes répartis en 3 populations génétiquement différenciées et corrélées à différents types de fromages à pâte persillée. Sur la base de ces résultats, 55 isolats représentatifs ont par la suite été criblés afin d’évaluer la possible existence d’un caractère haplotype-dépendant concernant les activités protéolytiques, lipolytiques et la production de métabolites secondaires volatils et non-volatils. Cette étude a permis de mettre en évidence une diversité fonctionnelle relativement importante avec, entre autres, l’identification de 52 molécules volatiles, les méthyl-cétones étant majoritaires dans le volatilome des cultures de P. roqueforti, et des profils de production de mycotoxines parfois contrastés. Cependant, une bonne corrélation a été observée entre les groupes d’isolats issus de fromages AOP ou IGP et les métabolites produits. Suite à l’observation de niveaux de productions contrastées d’acide mycophénolique retrouvées chez P. roqueforti, le cluster de gènes impliqué dans sa biosynthèse a été identifié in silico chez P. roqueforti avant que des expériences d'ARN interférence ne soient réalisées sur le gène mpaC codant une polycétide synthase. La fonctionnalité de l’ensemble du cluster a pu être confirmée par différentes approches et des comparaisons de séquences entre différentes souches ayant des productions d’acide mycophénolique contrastées ont permis de mettre en évidence une délétion de 174 pb au niveau du gène mpaC limitant cette production à des niveaux non détectables chez certaines souches. Ce dernier résultat a ainsi apporté un premier élément de réponse quant à la nature a priori souche-dépendante de la production de ce métabolite.

Several « technological » fungal species play an important role in the development of organoleptic properties and typicity of cheeses via their metabolic activities. However, despite an ancestral use and consumption of cheeses, there is still a lack of knowledge about both genetic and functional traits of certain mold species, in particular Penicillium roqueforti. This species, mainly used in blue-veined cheese production, largely contributes to the specific organoleptic properties in the final product via its intense lipolytic and proteolytic activities during ripening. P. roqueforti is characterized by high morphological diversity, largely revealed during this study, and has been associated with different technological names in the past raising the question about several species within P. roqueforti. Consequently, a phylogenetic study based on genealogical concordance principle (GC-PSR) was performed using eight loci on a large worldwide P. roqueforti collection and confirmed the presence of one single species. Taking into account this result, P. roqueforti intraspecific diversity was then assessed using 4 microsatellite markers and 28 haplotypes were identified and distributed in three genetically differentiated populations linked to blue-veined cheese types. Based on these results, 55 representative isolates were further screened to determine potential haplotype-dependent traits related to proteolytic and lipolytic activities and volatile and non-volatile secondary metabolite production. This study highlighted the outstanding functional diversity among strains with, among others, 52 volatile molecules identified, mainly methyl-ketones, and contrasted mycotoxin production profiles. Noteworthy, a clear relationship between PDO/PGI group isolates and produced metabolites was observed. Following the contrasted production of mycophenolic acid among isolates, the mycophenolic acid biosynthetic gene cluster was identified in silico in P. roqueforti and RNA interference experiments targeting the mpaC gene, encoding a polyketide synthase, were performed. The cluster was shown to be fully functional in this species. Moreover, the entire mycophenolic acid cluster was compared between three strains characterized by contrasted mycophenolic acid production and a 174 bp deletion was detected in the mpaC gene of non-producing strains. This last result provided first insight into the a priori strain-dependent character for production.