La dualité de l'apoptose des cellules du cancer du col de l'utérus ou la face de Janus de l'apoptose : un objectif thérapeutique et une implication dans le transfert horizontal d'oncogènes viraux

The duality of apoptosis of cervical cancer cells or the Janus face of apoptosis : a therapeutic purpose and involvement in the horizontal transfer of viral oncogenes

• Auteur / Autrice : François Hermetet
• Direction : Christiane Mougin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 02/12/2015
• Etablissement(s) : Besançon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Carcinogénèse épithéliale : facteurs prédictifs et pronostiques (Besançon) - Carcinogénèse épithéliale : facteurs prédictifs et pronostiques -
• Jury : Président / Présidente : Pierre Oudet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christiane Mougin, Pierre Oudet, Christophe Hourioux, Murielle Masson, Régis Delage-Mourroux
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Christophe Hourioux, Murielle Masson

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfert génétique

Flavonoïdes

Fibroblastes

Papillomavirus humains

Cancer

Col de l'utérus

Apoptose

Mots clés libres

Apoptose

Isoliquiritigénine

Cancer du col de l'utérus

Papillomavirus humain

Efferocytose

Transfert horizontal de genes

Fibroblaste primaire humain

BAI1

Apoptosis

Isoliquiritigenine

Cervical cancer

Human papillomavirus

Efferocytose

Horizontal gene transfer

Human primary fibroblast

BAI1

Résumé

À l'heure actuelle, une large proportion des recherches vouées à l'identification et au développement de nouvelles thérapies anticancéreuses est basée sur l'apoptose. Dans les dernières décennies, divers composés phytochimiques ont été caractérisés comme des agents pharmacologiques susceptibles d'éliminer les cellules cancéreuses via l'induction de l'apoptose. Parmi ceux-ci, l'isoliquiritigénine (ILG), un flavonoïde naturellement présent dans les racines de réglisse, se distingue des autres par ses nombreuses propriétés thérapeutiques incluant une activité antitumorale. Chez les mammifères, les cellules apoptotiques (CA) peuvent être complètement dégradées via leur capture par des cellules phagocytaires spécialisées ou servir de vecteurs d'ADN dans un processus appelé transfert horizontal de gènes (THG). Ainsi, il a été mis en évidence que des CA dérivées de cancer du col de l'utérus peuvent induire le transfert de séquences d'oncogènes de papillomavirus humains (HPV) à des fibroblastes primaires humains (HPFs) qui acquièrent des propriétés de cellules transformées. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l'internalisation de CA par les fibroblastes, un modèle de phagocyte non-professionnel, n'ont pas encore été clairement identifiés et la caractérisation de ces événements qui précèdent le THG est essentielle à la compréhension de ce processus et de la transformation des cellules receveuses qui peut en découler.Dans ce contexte, les objectifs de cette thèse étaient, (i) d'analyser les effets anticancéreux de l'ILG sur des cellules dérivées de cancer du col de l'utérus, (ii) de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la capture des CA par les HPFs, (iii) d'étudier les événements cellulaires qui font suite à ce processus comme la maturation des phagosomes, le THG et l'acquisition de propriétés de transformation et enfin, (iv) de démontrer la preuve de la conservation de la capacité tumorigénique des CA in vivo.Un premier travail a permis de mettre en lumière les propriétés antitumorales de l'ILG via une multiplicité d'actions sur des modèles cellulaires de cancer du col de l'utérus in vitro, incluant des activités anti-proliférative, pro-apoptotique, anti-migratoire. Concernant la lignée cellulaire Ca Ski, p53 sauvage et représentative du carcinome du col utérin le plus fréquent, associé à une infection transformante par HPV16, l'apoptose induite par l'ILG semble dépendante de p53 et de la mitochondrie, mais aussi de la voie des récepteurs de mort, comme attesté par l'augmentation des niveaux de protéines p53 et p21, la dissipation du potentiel membranaire mitochondrial, la libération du cytochrome c et le clivage des caspases-9, -8 et -3. Ces effets pourraient être la conséquence de la diminution de l'expression de l'oncoprotéine virale E6 d'HPV16 induite par l'ILG entraînant la restauration de l'expression de p53. Nos travaux révèlent un fort potentiel de l'ILG contre différents types de cellules malignes et ouvrent le champ à de nouvelles modalités de traitement des cancers associés à HPV.

Most of the research strategies aiming at improving anticancer therapies currently target apoptosis. Over the last decades, several natural products derived from herbal medicine or food have been identified as pharmacological agents for cancer cell elimination through apoptosis induction. Among them, isoliquiritigenin (ILG) is a chalcone derivative isolated from liquorice and shallots which exhibits a wide variety of biological functions including antitumor properties.In mammals, apoptotic cells (AC) can either be eliminated after their capture by specialized phagocytes or act as vectors of DNA in a process named horizontal gene transfer (HGT). For instance, AC derived from cervical cancer cells can transfer human papillomavirus (HPV) oncogene sequences to human primary fibroblasts (HPFs) which subsequently acquire transformed cell properties. The molecular mechanisms underlying AC uptake by HPFs, a model of non-professional phagocytes, have not been clearly identified. Characterizing these upstream events appears critical to broaden our understanding of HGT and the ultimate transformation of recipient cells which may subsequently occur.The aims of this work were to (i) study the antitumor effects of ILG on cervical cancer cell lines,(ii) characterize the cellular and molecular mechanisms underlying AC uptake by HPF, (iii) study the cellular events which occur in HPFs following AC engulfment such as phagosome maturation, HGT and acquisition of transformed properties, and (iv) evaluate the tumorigenic properties of AC in vivo.In a first part of this PhD project, we found that ILG exhibits multiple antitumor actions on cervical cancer cells in vitro including anti-proliferative, pro-apoptotic and anti-migration properties. Further studies on apoptosis-related events were conducted in Ca Ski cells (p53wt, HPV16 DNA positive), which are representative of the most frequent cervical carcinoma. The treatment of Ca Ski cells with ILG is associated with increased levels of p53 and p21 proteins, loss of mitochondrial membrane potential, cytochrome c release and caspase-9, -8 and -3 cleavage. These features suggest that ILG-induced apoptosis is dependent on p53 and involve both mitochondrial and death receptor- mediated pathways. The effect of ILG in Ca Ski cells may be partly explained by the decrease of HPV16 E6 oncoprotein expression and the associated raise of p53 levels observed after cell treatment. Our work highlights the potential of ILG as an antitumor agent and provides the opportunity of new treatment. ln the second part of this work, we set up a method based on flow cytometry to quantitatively analyze AC uptake. This original method and microscopy analysis allowed us to show that HPFs act as non-professional phagocytes and are able to engulf subcellular fragments rather than dying whole cells, with lower efficiency and rapidity compared to professional phagocytes as macrophages. Uptake of AC by HPFs depends on time, temperature and the presence of bivalent ions. Morphological analysis and fonctional assays using endocytosis inhibitors revealed a mechanism related to phagocytosis and/or macropinocytosis. The recognition of phosphatidylserine exposed on the surface of AC by their receptor BAIl has emerged as a required event for AC uptake by HPFs.