Imagerie quantitative d'orientation moléculaire dans les structures biologiques par microscopiesuper-résolution polarisée

Quantitative molecular orientation imaging of biological structures by polarized super-resolution fluorescence microscopy

• Auteur / Autrice : Haitham Ahmed Shaban Ahmed
• Direction : Sophie Brasselet, Francesco Saverio Pavone
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Optique, Photonique et Traitement d'Image
• Date : Soutenance le 02/04/2015
• Etablissement(s) : Aix-Marseille en cotutelle avec Università degli Studi di Firenze
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Physique et Sciences de la Matière (Marseille)
• Jury : Président / Présidente : Mauro Modesti
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sophie Brasselet, Francesco Saverio Pavone, Martino Calamai, Markus Sauer
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Martino Calamai, Markus Sauer

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie de fluorescence

Interactions ADN-protéine

Amyloïde

Imagerie en biologie

Microscopie de polarisation

Mots clés libres

Microscopie super-Résolution

Polarisation de fluorescence

Imagerie cellulaire

Structure amyloide

L'interaction ADN-Protéine

Single molecule

Super resolution

Fluorescence polarization

Cell imaging

Amyloid structure

DNA-Protein interaction

Résumé

Dans cette thèse, nous avons construit et optimisé des méthodes de microscopie de fluorescence super-résolue stochastique, polarisée et quantitative qui nous permettent d'imager l'orientation moléculaire dans des environnements dynamiques et statiques a l’échelle de la molécule unique et avec une résolution nanoscopique. En utilisant un montage de microscopie super-résolue à lecture stochastique en combinaison avec une détection polarisée, nous avons pu reconstruire des images d'anisotropie de fluorescence avec une résolution spatiale de 40 nm. En particulier, nous avons pu imager l'ordre orientationnel d'assemblages biomoléculaires et cellulaires. Pour l'imagerie cellulaire, nous avons pu étudier la capacité d'étiquettes de marquer fluorophoresde reporter quantifier l'orientation moléculaire dans l'actine et les microtubules dans des cellules fixées. Nous avons également mis à profit la meilleure résolution et la détection polarisée pour étudier l'ordre moléculaire d’agrégats d’amyloïdes a l’échelle nanoscopique. Enfin, nous avons étudié l'interaction de la protéine de réparation RAD51 avec l'ADN par microscopie de fluorescence polarisée super-résolue pour quantifier l'ordre orientationnel de l'ADN et de la protéine RAD51 afin de comprendre la recombinaison homologue du mécanisme de réparation de l'ADN.

.In this thesis we built and optimized quantitative polarized stochastic super-resolution fluorescence microscopy techniques that enabled us to image molecular orientation behaviors in static and dynamic environments at single molecule level and with nano-scale resolution. Using a scheme of stochastic read-out super resolution microscopy in combination with polarized detection, we can reconstruct fluorescence anisotropy images at a spatial resolution of 40 nm. In particular, we have been able to use the techniques to quantify the molecular orientationalorder in cellular and bio-molecular assemblies. For cellular imaging, we could quantify the ability of fluorophore labels to report molecular orientation of actin and microtubules in fixed cells. Furthermore, we used the improvements of resolution and polarization detection to study molecular order of amyloid aggregates at a nanoscopic scale. Also, we studied repair protein RAD51` s interaction with DNA by using dual color polarized fluorescence microscopy, to quantify the orientational order of DNA and RAD51 to understand the homologous recombination of DNA repair mechanism.