Apport de la cytométrie en flux à l'étude des leucémies aigües myéloïdes

Contribution of flow cytometry in the study of acute myeloid leukemia

• Auteur / Autrice : François Vergez
• Direction : Christian Récher
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologies, cancérologie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Leucémie aigüe myéloïde

Mots clés libres

Leucémie

Pi3k

Cellule souche leucémique

Cytométrie en flux

Hématopoïèse

Résumé

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont les leucémies les plus fréquentes de l'adulte. Leur incidence augmente chaque année. La cellule souche leucémique (CSL) dérive d'une cellule souche hématopoïétique (CSH) ou d'un progéniteur plus différencié, ayant accumulé plusieurs mutations oncogéniques. Elle est à l'origine de la leucémie et résiste aux chimiothérapies actuelles. Les cellules leucémiques sont d'accès facile au diagnostic et à la rechute, par cytométrie en flux (CMF). Cette technologie permet de phénotyper les cellules à l'aide d'anticorps marqués avec des fluorochromes. Nous pouvons ainsi identifier une cellule (i) engagée dans un processus de maturation ou (ii) appartenant à une sous-population cellulaire ou (iii) résistante à une chimiothérapie. Et des centaines de milliers de cellules peuvent être phénotypées. La CSH se différentie en progéniteurs puis en cellules sanguines matures. Les mécanismes de leucémogenèse bloquent cette différentiation. Le phénotype étendu des précurseurs hématopoïétiques permet de déterminer le stade de blocage des leucémies. Ce blocage corrèle avec les mutations oncogéniques. Plus le blocage intervient tôt dans le processus de différentiation et plus le pronostic des patients est péjoratif. L'identification du stade de blocage par CMF permet d'envisager de nouvelles voies thérapeutiques. Les CSL chimiorésistantes sont enrichies dans la sous-population leucémique CD34+CD38-CD123+. Le pourcentage de cellules CD34+CD38-CD123+ a été déterminé par CMF chez 111 patients de moins de 65 ans atteints de LAM et traité par chimiothérapie intensive. La réponse au traitement est mauvaise chez les patients qui ont plus de 15% de CSL. Les survies globale et sans maladie sont impactées chez les patients qui ont plus de 1% de CSL. Le pourcentage de CSL, déterminé par CMF, est un facteur pronostic des LAM facilement applicable à la pratique clinique. PIK-75, un inhibiteur de la sous-unité p110alpha des PI3K, est un puissant inducteur d'apoptose des cellules leucémiques et des CSL, comme l'indique la positivité en annexine V et 7-AAD par CMF. De façon originale, PIK-75 bloque les voies PI3K et CDk7/9 qui stoppe la transcription de MCL-1, un membre de la famille de Bcl-2 et un acteur important de la survie des cellules de LAM. La sensibilité des cellules leucémiques à PIK-75 est dépendante de l'expression de BAK. La CMF permet un criblage in vitro rapide de molécules inhibitrices, à la recherche de nouvelles cibles et résistance dans les cellules leucémiques. La CMF est une technologie adaptée à la LAM qui est une pathologie hétérogène. Elle permet de décrypter les mécanismes de leucémogenèse, identifier les sous-populations chimiorésitantes et évaluer de nouvelles thérapeutiques, ce qui la place au premier plan de la recherche et de la clinique des LAM.

Acute myeloid leukemias (AML) are the most common adult leukemias. Their incidence grows every year. The leukemic stem cell (LSC) arises from a hematopoietic stem cell (HSC) or a more differentiated progenitor that accumulates oncogenic mutations. LSC initiates leukemia and resist to current chemotherapies. Leukemic cells are very accessible at diagnose or relapse by flow cytometry (FCM). This technology allows to phenotype cells with fluorochrome labeled antibodies. We can identify that one cell is (i) committed in a maturation process or (ii) belonging to cellular sub-population or (iii) chemoresistant. And hundreds of thousands of cells can be processed. HSC differentiates in more committed progenitors then in mature blood cells. Leukemogenesis blocks this commitment. Enlarged phenotype of normal hematopoietic precursors allows us to determine the blockage stage of AML. This blockage stage is correlated with oncogenic mutations. Earlier in hematopoiesis it is, worse is the patient prognosis. Identification of blockage stages by FCM allows thinking about new therapeutics. Chemoresistant LSC are enriched in the leukemic sub-population CD34+CD38-CD123+. The percentage of CD34+CD38-CD123+ cells has been determined by FCM in 111 AML patients less than 65 and intensively treated. Response to treatment is lower in patients with more than 15% of LSC. Overall and disease free survivals are decreased in patients with more than 1% of LSC. Globally, percentage of LSC determined by FCM is a prognostic factor in AML easily applicable in daily practice. PIK-75, an inhibitor of isoform p110alpha of PI3K, importantly induces apoptosis in leukemic bulk and LSC, as shown by AnnV/7AAD FCM positivity. Originally, PIK-75 blocks PI3K pathway and CDK7/9 pathway that in turn stops MCL-1 transcription. Mcl-1 is a member of the Bcl-2 family and a key driver of leukemic cell survival. Sensitivity of leukemic cells to PIK-75 is largely dependent of the expression of BAK. FCM allows a quick in vitro screen of inhibitory compounds to seek for new targets and resistance in leukemic cells. FCM is a technology that fit well to AML, a heterogeneous pathology. It allows us to decrypt leukemogenesis mechanism, to identify chemoresistant leukemic subsets and to evaluate new drugs; which make of this, one of the first tools in AML research and clinic.