Role of mediator complex subunits in transcriptional regulation by GATA and FOG transcription factors during Drosophila development

Rôle des sous-unités du complexe Médiateur dans la régulation transcriptionnelle par les facteurs de transcription GATA et FOG au cours du développement de la drosophile

• Auteur / Autrice : Clément Immarigeon
• Direction : Muriel Boube, Henri-Marc Bourbon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique moléculaire
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Drosophiles

Transcription génétique

Mots clés libres

Mediator complex

Transcription

Transcription factors

Gata

Fog

Drosophila

Development

Genetics

Résumé

Un enjeu majeur en Biologie est de comprendre comment les milliers de gènes composant le génome sont contrôlés afin d'être exprimés dans les bonnes cellules au bon moment. Cette régulation a lieu en grande partie à l'étape de pré-initiation de la transcription. Ce processus résulte de l'action concertée de nombreuses protéines, dont le complexe Médiateur (MED, ~30 sous-unités protéiques ou SU, >1,5MDa) qui joue un rôle conservé dans la régulation de la transcription des gènes par l'ARN Polymérase II (PolII), de la levure à l'Homme. Ce complexe se lie simultanément à la PolII et aux facteurs de transcription spécifiques (FT). Les FT reconnaissent et se fixent à des séquences régulatrices d'ADN, et dirigent l'expression de leurs gènes-cibles au cours du développement. Le complexe MED, ubiquitaire dans les cellules eucaryotes, semble intégrer le " code des FT " spécifique à chaque cellule, et réguler en conséquence le recrutement et l'activité de la PolII au promoteur des gènes-cibles des FT. La drosophile est un organisme modèle fournissant des outils génétiques puissants pour répondre à des questions biologiques importantes in vivo, notamment concernant la transcription génique. Une famille de FT, les GATA, est impliquée dans des processus développementaux similaires chez les mammifères et la mouche. Ils activent et répriment la transcription, selon le gène considéré et la présence de certains cofacteurs comme les protéines FOG. Le travail présenté ici vise à comprendre comment les FT GATA utilisent le MED pour réguler la transcription de leurs gènes cibles, positivement et négativement. Au cours de ce travail, nous avons généré les premières lignées mutantes pour le gène Med1, et entrepris la caractérisation des fonctions de la SU Med1, connue pour être un cofacteur des FT GATA chez les vertébrés. Nous avons montré que certaines SU MED (dont Med1, 12, 13, 15 et 19) sont impliquées dans des processus dépendant des GATA, tels que l'hématopoïèse, la morphogénèse du notum et la formation des soies mécanosensorielles dorso-centrales. Les deux derniers dépendent du FT GATA Pannier (Pnr) qui, seul, active la transcription des gènes pro-neuraux ac-sc, ou la réprime en présence de son partenaire FOG U-shaped (Ush). Des analyses clonales in vivo ont révélé que Med1, Med15 et Med19, ainsi que Med12 et Med13 appartenant au module détachable CDK8, sont critiques pour l'activation d'ac-sc de façon cellulaire-autonome, suggérant un lien fonctionnel avec Pnr. De manière intéressante, CycC et Cdk8 du module CDK8 ne sont pas requises pour l'activation d'ac-sc, mais sont requises pour sa répression dans les cellules voisines, soulignant la diversité d'action des SU MED in vivo. Med19 interagit physiquement avec Pnr, et pourrait donc être le point d'ancrage par lequel Pnr recrute le MED pour activer la transcription. De plus, le facteur FOG Ush inhibe l'interaction Med19-Pnr en formant un hétérodimère Pnr-Ush. La compétition pour se fixer à Pnr entre Med19 (co-activateur) et Ush (co-répresseur) pourrait expliquer les actions antagonistes de Pnr sur ses gènes-cibles. Med19 est également requise pour la transactivation par un autre GATA : Serpent (Srp, cf. Gobert et al. 2010). Nous montrons ici que Med19 interagit également avec Srp, suggérant que Med19 pourrait être un cofacteur général des GATA, alors que Med1 ne semble pas avoir d'affinité pour les GATA chez la drosophile (contrairement à la SU Med1 chez les mammifères). Cela soulève des questions quant à la manière par laquelle les interactions entre FT et SU MED apparaissent, puis sont conservées, ou non, au cours l'évolution. Ces résultats mettent en lumière des interactions croisées entre Med19, GATA-Pnr et FOG-Ush qui permettent de comprendre mécanistiquement comment Pnr active et réprime la transcription. Ce travail représente une étape importante pour la compréhension de la façon dont les combinatoires de FT sont intégrées par le MED pour aboutir à une régulation fine de la transcription.

A major aim of today's research in Biology is to understand how the thousands of genes composing the genome are regulated in order to be expressed in the right cells at the right time. This regulation occurs in large part before gene transcription, at the pre-initiation step. This process results of the concerted action of many proteins, including the large Mediator complex (MED, ~30 protein subunits, >1. 5 MDa), which plays a conserved and crucial role in the regulation of protein-coding genes transcription by RNA polymerase II (PolII), from yeast to humans. This modular complex makes direct core contacts with PolII and general transcription factors, while some subunits can bind to DNA-bound specific transcription factors (TFs). TFs recognize and bind specific regulatory DNA sequences, and drive the tissue-specific expression of their target genes during development. The ubiquitously expressed MED is thought to integrate a cell-specific STF "code" to regulate PolII recruitment and activity at gene promoters. Drosophila melanogaster is a valuable animal model that provides many genetic tools - such as mutant strains and transgenic lines - to address important biological questions in vivo, such as how gene transcription is regulated. A family of TFs, the GATAs, is involved in diverse developmental processes in both Drosophila and vertebrates. They are both activator and repressor TFs, depending on the target gene and the available cofactors, such as Friend Of GATA (FOG) family proteins. The work presented here aimed to understand how GATA TFs use the MED to regulate their target genes both positively and negatively. During the course of this work we generated the first Drosophila mutants for Med1, and investigated the functions of this important subunit in vivo, known as a cofactor of GATAs in vertebrates. We identified a subset of Drosophila MED subunits (including Med1, 12, 13, 15, 19) which are required for proper GATA-dependent processes, such as haematopoiesis, notum morphogenesis and dorso-central (DC) mechanosensory bristle emergence. The last two processes depend on Pannier (Pnr), a GATA-type TF, which directly activates achaete-scute (ac-sc) proneural genes transcription singly, and represses it in presence of its FOG partner U-shaped (Ush). Clonal analysis in vivo showed that Med1, Med15 and Med19, along with Med12/13 subunits of the detachable "CDK8" module of the MED, are critical for ac-sc activation in a cell-autonomous manner, suggesting functional interactions with Pnr. Interestingly, CycC and Cdk8 subunits from CDK8 module are not involved in ac-sc activation, but are required to ensure ac-sc inhibition in surrounding cells, underscoring the diversity of MED subunits functions in vivo. Moreover, we show that Med19 binds physically to Pnr. Thus, Med19 might be the anchor point by which Pnr recruits the MED at Pnr-activated genes. Furthermore, the FOG factor U-shaped inhibits Med19-Pannier interaction by heterodimerizing with Pannier. Thus, the competition for Pnr binding between Med19 (coactivator) and Ush (corepressor) could be responsible for the antagonistic roles of Pnr on the transcription of its target genes. Interestingly, Med19 is also required for transactivation by another GATA factor: Serpent (Srp, cf. Gobert et al. , 2010). Here we show that Med19 also interacts physically with Srp, suggesting that Med19 could be a general cofactor of GATAs in drosophila. On the other hand, Med1 showed no affinity for Drosophila GATAs (contrary to vertebrate Med1), raising questions about the way MED-TF interactions are acquired and maintained, or not, during evolution. This work highlights the interplay between Med19, GATA-Pnr and FOG-Ush, allowing a mechanistic understanding of Pnr actions as both an activator and a repressor of gene transcription. This PhD thesis is an important step towards appreciating how combinatorial codes of TFs are integrated by the MED to regulate gene transcription during development.