Implication de la protéine mitochondriale OPA1 dans l'homéostasie redox et caractérisation de ses partenaires protéiques : quelles conséquences sur la pathogenèse de l'atrophie optique dominante de type 1 ?

Involvement of the mitochondrial protein OPA1 in redox state regulation and characterization of OPA1-partners : which consequences in dominant optic atrophy pathogenesis ?

• Auteur / Autrice : Aurélie Millet
• Direction : Noélie Davezac, Pascale Belenguer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et physiopathologie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Oxydoréduction

Atrophie optique

Mitochondries

Mots clés libres

Mitochondrie

Métabolisme oxydatif

Défenses antioxydantes

Opa1

Etat redox

Atrophie optique dominante de type 1 (ADOA-1)

Résumé

L'Atrophie Optique Dominante de type 1 (ADOA-1) est une rétinopathie héréditaire qui se traduit par une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine suivie d'une atrophie du nerf optique. L'ADOA-1 est caractérisée par une diminution de l'acuité visuelle, pouvant entraîner la cécité et reste à l'heure actuelle sans recours thérapeutique. Une forme syndromique nommée '' ADOA-1 plus '' touche environ 20% des patients et se traduit par des atteintes extra-oculaires de type ataxie ou surdité. Des mutations du gène codant la protéine mitochondriale OPA1 ont été décrites comme responsables de l'ADOA-1 et aboutissent dans la majorité des cas à un phénomène d'haploinsuffisance. De nombreuses études ont montré que la dynamine OPA1 est impliquée dans la fusion des membranes internes mitochondriales et possède un rôle anti-apoptotique. Des travaux menés sur des modèles cellulaires ou invertébrés de l'ADOA-1 suggèrent une implication de la dynamine dans le métabolisme oxydatif mitochondrial mais ces données restent toutefois controversées et les mécanismes moléculaires sous-jacents inconnus. C'est pourquoi nous avons analysé l'homéostasie redox de la cellule en étudiant l'état du métabolisme oxydatif et la mise en place des défenses antioxydantes. Parallèlement, nous avons identifié l'environnement protéique d'OPA1, par une approche de protéomique, afin de préciser les mécanismes moléculaires impliqués notamment dans les fonctions identifiées de la dynamine. Des cellules humaines (HeLa) et des neurones corticaux (rat) en culture primaire ont été traités par une stratégie d'interférence ARN pour diminuer l'expression d'OPA1 et ainsi mimer un phénomène d'haploinsuffisance. Dans ces deux modèles, la quantité et l'activité de la chaîne respiratoire mitochondriale sont diminuées ainsi que l'activité de l'aconitase, (une enzyme sensible aux taux d'Espèces Actives de l'Oxygène (EAOs) intra-mitochondriaux) suggérant que le métabolisme oxydatif des cellules est perturbé. La réponse antioxydante a été mesurée par l'analyse d'une des voies principales de détoxification faisant intervenir le facteur de transcription NRF2, qui est activé dans les deux modèles invalidés pour OPA1. De plus, certaines enzymes cibles de NRF2, comme les superoxydes dismutases 1 et 2 (SOD1/2), la catalase et GSTP1, voient leur quantité et/ou leur activité augmentées. Ainsi, la perte d'OPA1 induit une dérégulation de l'homéostasie redox : les cellules sont dans un état pro-oxydant. Lors de l'application d'un stress oxydatif exogène aigu, les neurones traités par un siOPA1 ne voient pas leurs défenses antioxydantes augmentées et meurent plus que les cellules contrôles, suggérant une saturation des activités antioxydantes. Ensuite, nous avons montré une diminution drastique de l'activité de l'aconitase de cortex de souris modèles de l'ADOA-1, à 4 et 10 mois, caractéristique d'une production élevée d'EAOs mitochondriaux. Ainsi, comme les modèles cellulaires, les souris mutées pour OPA1 sont dans un état pro-oxydant. Nous avons de plus analysé l'expression des enzymes antioxydantes dans des fibroblastes de peau de patients atteints d'ADOA-1. Certains individus présentent des niveaux protéiques d'enzymes de détoxification très faibles, notamment les SOD1 et 2. Ces patients seraient donc plus sensibles aux stress exogènes tels que les UVs ou l'hypoxie, ce qui constituerait un facteur aggravant de la pathologie. Enfin, les résultats de l'intéractome de la dynamine ont permis l'identification de 3 protéines partenaires (dans 3 réplicats biologiques), dont une enzyme du métabolisme oxydatif, appuyant l'implication d'OPA1 dans la régulation de l'état redox. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles pistes pour la compréhension de la pathogenèse de l'ADOA-1 et permettraient de proposer des perspectives thérapeutiques à court terme, comme l'utilisation de molécules antioxydantes, pour prévenir ou retarder l'atrophie optique et/ou les syndromes extra-oculaires des patients.

Dominant Optic Atrophy (DOA) is a common cause of inherited visual failure affecting at least 1 in 50 000 persons in Europe. OPA1 mutations are the main genetic cause of DOA, causing bilateral symmetrical optic atrophy due to specific loss of retinal ganglion cells. Although optic nerve degeneration remains the hallmark of DOA, a syndromic form called ''DOA plus'', including deafness, ataxia and/or myopathy, was recently reported to affect up to 20% of all mutations carriers. More than 200 mutations have been listed, most are truncations in line with haploinsufficiency being the major pathogenic mechanism of DOA. OPA1 is a dynamin anchored to the inner mitochondrial membrane and involved in mitochondrial dynamics, and also has an anti-apoptotic function. Some reports using cellular or invertebrate models of DOA suggest a role of OPA1 in oxidative metabolism, but they still remain controversial and the precise mechanistic involved in DOA pathogenesis is still unknown. To characterize the molecular and cellular consequences of OPA1 loss of function (depletion or mutations), we have studied intracellular redox homeostasis through oxidative metabolism and antioxidant defenses. In addition, we have looked for OPA1-partners to unravel the dynamin functions. To mimic haploinsufficiency in human cells (HeLa) and in rodent cortical neurons in primary culture, OPA1 was down-regulated by an RNA interference strategy. In both models, the amount and activity of the mitochondrial respiratory chain proteins is decreased, as well as the activity of aconitase, which is sensitive to intra-mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS), indicating that the cellular oxidative metabolism is disturbed. To evaluate the cellular antioxidant responses, we focused on the major detoxification pathway centered on the NRF2 transcription factor, which we found active in both OPA1 down-regulated cellular models. Furthermore, some NRF2 target proteins quantity and/or activity are increased, such as superoxide dismutase 1 and 2 (SOD1, 2), catalase and GSTP1. Thus, down-regulation of OPA1 induced a deregulation of redox homeostasis: cells are in a pro-oxidative state. Moreover, upon application of an acute exogenous oxidative stress, OPA1-depleted neurons do not show any increase of their antioxidant defenses and die earlier than control cells. We hypothesize that these OPA1-depleted cells become sensitive to oxidative stress, which could induce cell death since the antioxidant machinery can not be further activated. To extend our analysis to a more physiological model, we measured the redox state status of cortices of OPA1+/- mice. We found a high ROS level in cortices of 4 and 10 month-old animals, evaluated indirectly by aconitase activity drastic decrease. Thus, like the cellular models, OPA1+/- mice appear to be in a disturbed redox state. Since the redox homeostasis deregulations observed in cellular and animal models could explain DOA pathogenesis, we determined if these disturbances were found in patients' cells. We evaluated antioxidant enzymes quantities in skin fibroblasts of DOA patients and found cases of very low defenses, for instance of superoxide dismutase, a key ROS detoxifying enzyme. Thus, these patients may be more sensitive to exogenous stress such as UV or hypoxia, which can be aggravating factors of the disease and could lead to accelerated RGC loss. Finally, to shed more light on OPA1 functions, we conducted an interactome analysis to identify its protein partners, in rodent primary cortical neurons. Among the 3 proteins identified in 3 independent replicates, we found an oxidative metabolism enzyme, in line with our previous results on the involvement of OPA1 in redox state regulation. Therefore, our results open novel ways for the understanding of DOA pathogenesis and could provide therapeutic perspectives, such as the use of antioxidant molecules to prevent or slowdown optic atrophy and extra-ocular symptoms.