Internalization and intracellular trafficking of plasmid DNA delivred by electroporation in vitro

• Auteur / Autrice : Christelle Rosazza
• Direction : Marie-Pierre Rols, Andreas Zumbusch
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transfert génétique

Endocytose

Électroporation

Mots clés libres

Electroporation

Endocytose

Transport actif

Suivi de particule unique

Trafic endosomal

Cytosquelette

Colocalisation dynamique

Adn

Résumé

L'électroporation est une méthode physique de délivrance de molécules dans les cellules ou tissus. Le transfert des petites molécules se déroule vraisemblablement par diffusion à travers de présumés electropores alors que le transfert d'ADN plasmidique est plus compliqué et reste à élucider. Lors de l'application des impulsions électriques, la membrane devient perméable et l'ADN est électrophorétiquement poussé vers celle-ci où il est inséré en agrégats distincts pendant une dizaine de minutes. Ensuite, l'ADN est internalisé, navigue à travers le cytoplasme jusqu'à atteindre le noyau où l'expression de l'ADN est initiée. Mon travail de thèse se concentre sur l'internalisation et le trafic intracellulaire de l'ADN, deux étapes assez peu décrites dans le cadre de l'électroporation. L'internalisation de l'ADN semble se faire majoritairement par endocytose. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de l'endocytose et de marqueurs fluorescents permet de conclure que l'endocytose médiée par la clathrine et les rafts lipidiques ainsi que la macropinocytose sont impliquées (respectivement 25%, 50% et 30%). L'endocytose semble être la principale (sinon la seule) voie par laquelle les agrégats d'ADN entrent dans les cellules. De plus amples recherches doivent être menées pour dépeindre précisément le mécanisme d'internalisation de l'ADN d'autant plus que l'endocytose médiée par les rafts lipidiques représente un large panel de possibilités (caveoline, flotilline, GEEC. . . ). Nos résultats sont en accord avec la distribution spatiotemporelle de l'ADN observée à la membrane. Une fois dans le cytoplasme, l'ADN semble suivre le trafic endosomal classique. La colocalization en dynamique effectuée dans des cellules exprimant séparément plusieurs marqueurs d'endosomes (Rab5, Rab11, Rab9 et Lamp1) démontre que l'ADN est présent dans les endosomes précoces, de recyclages et tardifs dans des proportions calculées pour être respectivement 70%, 50% et 30%, valeurs moyennées sur l'heure qui suit l'électrotransfert. Entre 1-2 h après la délivrance, 60% de l'ADN est situé dans des structures marquées Lamp1 avec une prédominance probable des lysosomes. Ces résultats sont en accord avec l'observation de l'ADN toujours présent en agrégats dans le cytoplasme et ils renforcent l'observation d'un mécanisme d'endocytose mentionné précédemment. L'ADN dans le cytoplasme est transporté activement par les filaments d'actine et les microtubules. L'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques combinée au suivi de particules uniques effectué sur un grand nombre d'agrégats d'ADN clairement démontre que le cytosquelette contrôle la migration de l'ADN dans le cytoplasme. L'ADN exhibe le mouvement typique des endosomes avec des phases intermittentes de transport actif et de diffusion. Les phases de transport actif ont en moyenne une vitesse de 250 nm/s, une persistance de 6 s et engendre un déplacement de 1,3 µm. Cependant, les distributions de ces paramètres sont larges avec des vitesses allant de 50 nm/s à 3400 nm/s, des déplacements de 0,1 µm à 12 µm et des durées de 2 s à 30 s. Ces résultats confirment d'autres travaux qui présentent les microtubules comme un moyen de migration de l'ADN dans les cellules. Cela est aussi en accord avec la présence de l'ADN dans des endosomes vu que leurs membranes contiennent des protéines (probablement Rabs) capables de se lier aux moteurs moléculaires. De plus, cela explique comment les gros agrégats d'ADN peuvent traverser le cytoplasme dense et atteindre avec succès le noyau, phénomène improbable par simple diffusion. Le chemin de l'ADN que nous décrivons est efficace étant donné que la perturbation d'une étape intermédiaire entraine une réduction de l'expression génique. Bien que nos découvertes doivent être confirmées et nécessitent de plus amples investigations, la prochaine étape clé à comprendre est l'échappement supposé de l'endosome qui doit forcement se réaliser afin d'obtenir une expression de l'ADN.

Electroporation is a physical method of delivery of molecules into cells or tissues. The transfer of small molecules most likely occurs via diffusion through putative induced electropores whereas the transfer of plasmid DNA is more complex and remains to be elucidated. During the electric field pulses, the membrane becomes permeable and the DNA is electrophoretically pushed on it where it is inserted as discrete clusters for tens of minutes. After the electric pulses, DNA is internalized, navigates through the cytoplasm until it reaches the nucleus where DNA expression is initiated. This PhD work focuses on the internalization and intracellular trafficking of the DNA, two steps rather enigmatic in the context of electroporation. The relevant cell structures that could participate into these steps are the endocytotic machinery followed by the endosomal trafficking and the cytoskeleton (actin filaments and microtubules). DNA internalization seems to be mainly performed via endocytosis. The use of pharmacological endocytic inhibitors combined with endocytic markers led us to the conclusion that clathrin- and lipid raft-mediated endocytosis as well as macropinocytosis are involved (25%, 50% and 30%, respectively). Endocytosis seems to be the main (if not the only) path by which DNA aggregates enter the cells. More investigations have to be done to depict precisely the DNA internalization mechanism especially because raft-mediated endocytosis represents a large panel of possibilities (caveolin, flotillin, GEEC. . . ) which are worth describing. These findings are in agreement with the observed spatiotemporal distribution of the DNA aggregates at the membrane (clusters of few hundreds of nm persisting for few min and inaccessible from the extracellular medium). Once inside the cells, DNA seems to follow the classical endolysosomal trafficking. Dynamic colocalization performed in cells expressing separately several labeled endosomal markers (Rab5, Rab11, Rab9 and Lamp1) allows us to conclude with no ambiguity that DNA is present in early, recycling and late endosomes in proportions calculated to be respectively 70%, 50% and 30% over the hour following the DNA electrotransfer. Between 1-2 h after delivery, 60% of the DNA is located in Lamp1-structures with most probably a predominance of the lysosomes. These results are in agreement with the observed DNA being still in clusters in the cytoplasm and it reinforced the earlier mentioned mechanism of endocytosis. DNA in the cytoplasm is actively transported by both the actin filaments and the microtubules. The use of pharmacological inhibitors combined with SPT performed on a high number of DNA aggregates clearly shows that cytoskeleton mediates the DNA journey in the cytoplasm. DNA exhibits the typical motion of endosomes with intermittent phases of active transport and diffusion. Under our experimental conditions, active motion phases features on average velocity of 250 nm/s and persistence of 6 s and leads to a displacement of 1. 3 µm. However, distributions of theses parameters are broad with velocities from 50 nm/s to 3400 nm/s, displacements from 0. 1 µm to 12 µm and persistence from 2 s to 30 s. These findings confirm previously published article pointing at the microtubules as a means of DNA migration in the cells. It is also in agreement with DNA being in endosomes since their membranes process proteins (probably Rabs) that can bind molecular motors. In addition, it explains how such big DNA clusters can travel through the highly crowded cytoplasm since successful to reach nucleus diffusion is improbable. The DNA route(s) we described correspond to the efficient one(s) since disturbance of any intermediate step results in a reduced gene expression. Although our findings must be confirmed and further investigated, the next key step to unravel is the putative endosomal escape that has to occur for successful gene expression.