Étude de la fonction du complexe Bms1p/Rcl1p dans les étapes précoces de la synthèse des ribosomes et des connexions entre synthèse et maturation du pré-ARN ribosomique chez Saccharomyces cerevisiae

Functional study of the Bms1p/Rcl1p complex in early steps of ribosome synthesis and connections between pre-ribosomal RNA synthesis and maturation in saccharomyces cerevisiae

• Auteur / Autrice : Yasmine Al Kadri
• Direction : Anthony Henras, Yves Henry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique moléculaire
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Transcription génétique

Saccharomyces cerevisiae

Ribosomes

Mots clés libres

Ribosomes

ADN ribosomique

Polymérase I

GTPase Bms1p

Endonucléase Rcl1p

Résumé

Dans les cellules eucaryotes, la synthèse des ribosomes débute dans le nucléole par la transcription de l'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (pol. I). Cette transcription génère un transcrit ribosomique primaire précurseur des ARNr matures 18S, 5. 8S et 25S. Ce transcrit s'associe de manière co-transcriptionnelle avec certaines protéines ribosomiques, un grand nombre de facteurs d'assemblage et de maturation et des petites particules ribonucléoprotéiques pour générer une grande particule pré-ribosomique initiale. Celle-ci subit un processus de maturation complexe qui débute dans le nucléole et se termine dans le cytoplasme où se forment les sous-unités ribosomiques matures. La synthèse des ribosomes est l'un des processus cellulaires les plus coûteux en énergie, il doit donc faire l'objet d'une régulation minutieuse et être coordonné aux autres processus cellulaires fondamentaux. Comme mentionné précédemment, la synthèse des ribosomes fait intervenir environ 200 facteurs d'assemblage et de maturation des particules pré-ribosomiques. La fonction de l'énorme majorité d'entre eux reste encore inconnue et un des challenges actuels dans le domaine est de comprendre leur rôle moléculaire précis. Une partie de mes travaux de thèse a consisté en une étude structure/fonction du complexe Bms1p/Rcl1p impliqué dans la synthèse des ribosomes chez la levure. Rcl1p et Bms1p sont deux protéines nucléolaires essentielles qui forment un complexe requis pour la maturation de la petite sous-unité ribosomique (40S). Bms1p est une GTPase et Rcl1p est une endoribonucléase qui catalyse le clivage du pré-ARNr au site A2, l'étape qui sépare les deux voies de maturation conduisant aux sous-unités ribosomiques 40S et 60S. L'équipe de notre collaborateur Sébastien Fribourg (IECB, Bordeaux) a résolu la structure cristallographique de Rcl1p en complexe avec un fragment de Bms1p et a identifié les résidus situés à l'interface entre les deux protéines. La substitution de certains de ces acides aminés affecte l'interaction entre Bms1p et Rcl1p in vitro et induit des défauts de maturation des pré-ARNr in vivo. Nous avons montré que ces défauts sont probablement dus à un problème d'incorporation de Rcl1p dans les particules pré-ribosomiques. En effet, Bms1p et Rcl1p sont importées dans le noyau sous forme d'un complexe grâce à la séquence de localisation nucléaire (NLS) de Bms1p. Les deux protéines sont ensuite recrutées simultanément au sein des pré-ribosomes après l'incorporation des modules UTP-A et UTP-B mais indépendamment du recrutement de Rrp5p. Nos résultats suggèrent par ailleurs que la liaison de Bms1p au GTP n'est pas nécessaire au recrutement du complexe. Suite au clivage en A2, les deux protéines sont ensuite toutes les deux dissociées des particules pré-40S avant l'incorporation de Rio2p. Nos données indiquent donc que l'interaction directe entre Bms1p et Rcl1p est cruciale pour l'incorporation du complexe dans les pré-ribosomes chez la levure. Une autre partie de mes travaux de thèse a porté sur l'étude de la protéine Rpf2p, un composant des particules pré-ribosomiques pré-60S requis pour la synthèse de la grande sous-unité ribosomique. Différentes données de la littérature suggèrent que Rpf2p interagit avec des facteurs associés à la chromatine de l'ADNr. Nous avons confirmé certaines de ces interactions et nos résultats suggèrent par ailleurs que Rpf2p est associée in vivo à la chromatine de l'ADNr et plus particulièrement aux copies transcriptionnellement actives. Ces données suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans des mécanismes de modification de la chromatine nécessaires à la transcription par l'ARN Pol. I et en effet, des expériences de '' run-on '' nucléaire indiquent que la perte d'expression de Rpf2p affecte la transcription par l'ARN pol. I. Ces résultats préliminaires suggèrent que Rpf2p pourrait intervenir dans le couplage fonctionnel entre transcription de l'ADNr et maturation des particules pré-ribosomiques.

In eukaryotic cells, ribosome synthesis begins with the transcription of ribosomal DNA (rDNA) by RNA polymerase I (Pol. I) in the nucleolus. This transcription generates a primary transcript precursor to the mature 18S, 5. 8S and 25S. This transcript is co-transcriptionally associated with some ribosomal proteins, many assembly and maturation factors and a set of small ribonucleoprotein particles to generate a giant initial pre-ribosomal particle. This particle undergoes a complex maturation process which begins in the nucleolus and ends in the cytoplasm where the formation of mature ribosomal subunits occurs. Ribosome synthesis is one of the most energy-consuming cellular processes; it must be highly regulated and tightly coordinated with other fundamental cellular processes. As previously mentioned, ribosome synthesis involves around 200 dedicated to the assembly and maturation of pre-ribosomal particles. However, the function of the vast majority of them is still unknown and current challenges in the field are to understand their precise molecular role. Part of my thesis work consisted in the study of the structure / function of the Bms1p/Rcl1p complex involved in ribosome synthesis in yeast. Rcl1p and Bms1p are two essential nucleolar proteins that form a complex required for the maturation of the small ribosomal subunit (40S). Bms1p is a GTPase and Rcl1p is an endoribonuclease which catalyzes the cleavage of the pre-rRNA at site A2; the step which separates the two maturation pathways leading to the formation of ribosomal subunits 40S and 60S. The team of our collaborator Sébastien Fribourg (IECB, Bordeaux) has solved the crystal structure of Rcl1p in complex with a fragment of Bms1p and identified residues at the interface between the two proteins. The substitution of some of these amino acids affects the interaction between Rcl1p and Bms1p in vitro and induces defects in the maturation of pre-rRNA in vivo. We have shown that these defects are probably due to a problem in Rcl1p incorporation into pre-ribosomal particles. Indeed, Bms1p and Rcl1p are imported into the nucleus as a complex via the nuclear localization sequence (NLS) of Bms1p. Both proteins are then recruited simultaneously into pre-ribosomes after incorporation of UTP-A and UTP-B modules but independently of Rrp5p incorporation. Our results also suggest that the GTP-binding to Bms1p is not required for the recruitment of the complex. Following A2 cleavage, the two proteins are both released from pre-40S particles before Rio2p incorporation. Therefore, our data indicate that the direct interaction between Bms1p and Rcl1p is crucial for the incorporation of the complex into pre-ribosomes in yeast. Another part of my thesis work focused on the study of Rpf2p protein, a component of the pre-60S ribosomal particles required for the synthesis of the large ribosomal subunit. Various data from the literature suggest that Rpf2p interacts with rDNA chromatin associated factors. We have confirmed some of these interactions and our results suggest that Rpf2p is associated in vivo with rDNA chromatin and more particularly to transcriptionally active copies. These data suggest that Rpf2p could be involved in mechanisms of chromatin modification required for transcription by RNA Pol. I and indeed, nuclear ''run-on'' experiments indicate that the loss of Rpf2p expression affects transcription by RNA pol. I. These preliminary results suggest that Rpf2p could be involved in the functional coupling between rDNA transcription and maturation of pre-ribosomal particles.