Régulation épigénétique de hTERT dans le modèle de leucémie aiguë promyélocytaire NB4 et rôle de c-Myc

Epigenetic Regulation of hTERT in Human Acute Promyelocytic Leukemia Cell Line NB4 and Role of c-Myc

• Auteur / Autrice : Qingyuan Liu
• Direction : Evelyne Ségal-Bendirdjian
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 17/12/2014
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Homéostasie cellulaire et cancer - Reprogrammation des réponses biologiques et thérapies alternatives
• Jury : Président / Présidente : François Dautry
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Evelyne Ségal-Bendirdjian, François Dautry, Olivier Adotevi, Anne-Laure Guieysse-Peugeot
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Olivier Adotevi, Anne-Laure Guieysse-Peugeot

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cyclic AMP-Dependent Protein Kinases

Épigénétique

Gène c-myc

Télomérase

Mots clés libres

Télomérase

HTERT

Épigénétique

Méthylation

C-Myc

PKA

Telomerase

HTERT

Epigenetic

Methylation

C-Myc

PKA

Résumé

La régulation de la télomérase s’effectue à de nombreux niveaux dont la transcription de la sous-Unité catalytique (hTERT). Les travaux du laboratoire effectués sur les cellules NB4, modèle de Leucémie Aiguë Promyélocytaire (LAP), ont montré que l'acide rétinoïque tout-Trans (ATRA) réprime la transcription de hTERT. Cette répression peut être associée à la différenciation (cas des cellules NB4) ou en être dissociée conduisant à la mort des cellules (cas des cellules NB4-LR1 résistantes à la maturation induite par l’ATRA). A partir de la lignée NB4-LR1 a été sélectionnée la lignée NB4-LR1SFD résistante à cette mort cellulaire du fait de la ré-Expression de hTERT même en présence d’ATRA. Cependant cette résistance à la répression de hTERT peut être levée par le co-Traitement ATRA et trioxide d’Arsenic (As2O3) qui conduit à la mort des cellules. Il s'agit donc d'une propriété nouvelle de cette lignée dont le mécanisme reste à élucider.Les résultats obtenus par le laboratoire suggèrent l'importance du statut de méthylation de l’ADN du promoteur de hTERT jusque là peu explorée qui pourrait rendre compte de la résistance à la répression de hTERT. Mon projet a pour objectif de valider cette hypothèse en tirant profit de la diversité des réponses biologiques (différenciation, prolifération, mort cellulaire et expression de hTERT) des variants cellulaires du modèle NB4. Une coopération entre le statut épigénétique (méthylation de l’ADN et modification des histones) du promoteur de hTERT et la fixation de facteurs activateurs et/ou répresseurs sera étudiée. Le statut de méthylation du promoteur de hTERT sur une région allant de -2500pb à +1000pb par rapport au site d’initiation de la transcription a été étudié par la technique de séquençage (Illumina) après traitement des cellules NB4-LR1SFD par l’ATRA seul ou en combinaison avec As2O3. Le résultat obtenu à ce jour montre une hypométhylation d’une région limitée du domaine distal (de -1300pb à -800pb) du promoteur de hTERT associée à la répression de hTERT dans les cellules traitées par la combinaison ATRA+ As2O3 par rapport aux traitements seuls par ATRA ou As2O3. Ceci renforce l’importance du statut de méthylation de cette région du promoteur dans la régulation de l’expression de hTERT. Ce co-Traitement induit également une diminution de l’expression protéique de cMyc et WT1, et aussi de l’ADN methyltransférase 1 (DNMT1) suggérant un rôle de cette enzyme dans le maintien de la méthylation de cette région du promoteur de hTERT. Dans le but d’évaluer le rôle de c-Myc dans la régulation de hTERT, nous avons montré qu’un analogue de l’AMPc, le 8-CPT-CAMP, induisait une dégradation (en partie protéasome dépendant) de la protéine c-Myc dès 6h de traitement dans la lignée résistante NB4-LR1SFD et non la lignée parentale NB4. La lignée NB4-LR1SFD est caractérisée par un déficit en sous unité régulatrice PKA RII. Spécifique knock-Down de PKA RII et l’utilisation d’agonistes et d’antagonistes spécifiques de PKAI a montré : 1) PKAI et PKAII ont des rôles différents sur la stabilité de la protéine c-Myc; 2) le rapport PKAI/PKAII déterminait la stabilité de c-Myc suite à l’activation de la signalisation PKA. Ces résultats suggèrent un rôle possible de PKA comme régulatrice de expression de hTERT via son implication dans le maintien de la stabilité de la protéine c-Myc.

The regulation of telomerase occurs at various levels, including the transcriptional regulation of hTERT. Previous results in our laboratory from acute promyolocytic leukemia cell model NB4, have shown that all-Trans retinoid acid (ATRA) repress the transcription of hTERT. This repression can be associated with differentiation (in the case of NB4 cells), or be dissociated with differentiation and triggers cellular death (the case of maturation resistant NB4-LR1 cells). Another variant NB4-LR1SFD cells were isolated from NB4-LR1 cells with continuous presence of ATRA and were resistant to the cellular death induced by ATRA. In fact, this resistance is related to the re-Expression of hTERT in presence of ATRA. However, this resistance can be overcome by combination of ATRA and AS2O3 and triggers cellular death.The results obtained in our laboratory suggested the importance of the DNA methylation status in the promoter region of hTERT and could be the one mechanism of the resistance to the repression of hTERT induced by ATRA. My project is by taking the diversity of biological response of the NB4 cells variants to validate the hypothesis. And the cooperation between epigenetic modifications and the binding of transcriptional factors will be equally studied.The DNA methylation status in the promoter region of hTERT from -2500bp to +1000bp has been analyzed with the sequencing technique (illumina) in NB4-LR1SFD treated by ATRA alone or in combination with AS2O3. The results showed a distal hypomethylated region from -1300bp to -800bp associated with the repression of hTERT by the co-Treatment of ATRA and AS2O3 compared with the treatment by ATRA or AS2O3 alone. This result strengthens the importance of methylation status in this region in the regulation of hTERT. The co-Treatment induces also a diminution in protein expression of cMyc, WT1 and DNA methyltransferase 1 (DNMT 1), suggesting this enzyme may play a role in the maintenance of methylation level in this region.In order to evaluate the role of cMyc in the regulation of hTERT, we have shown that an analog de cAMP, 8-CPT-CAMP, induces degradation (partly proteasome-Dependent) of c-Myc protein since 6h in NB4-LR1SFD cells but not in NB4 cells. NB4-LR1SFD cells are characterized by a defect of the PKA regulatory subunit II. Specific knockdown of PKA RII and utilizations of agonists and antagonists of PKA I have shown that: 1) PKA I and PKA II have distinct functional roles on the steady-State of c-Myc protein. 2) The ratio of PKA I/PKA II determines the stability of c-Myc protein with the activation of PKA signalization. These results suggest a possible role of PKA in the regulation of hTERT expression through its modulation on the stability of c-Myc.