Etude des protéines à motif PQ : Identification d'un nouveau transporteur lysosomal impliqué dans le traitement de la cystinose et analyse bioinformatique de la famille protéique

PQ-loop Protein Study : Identification of a New Lysosomal Transporter Involved in Cystinosis Treatment and Bioinformatic Analysis of its Proteic Family

• Auteur / Autrice : Adrien Jézégou
• Direction : Bruno Gasnier
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 25/11/2014
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Neurophotonique UMR 8250. Unité mixte de recherche (Paris ; 2014-2018)
• Jury : Président / Présidente : Marc Le Maire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Gasnier, Marc Le Maire, Bruno Miroux, Roland Salesse, Salah El Mestikawy, Vasiliki Kalatzis
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Bruno Miroux, Roland Salesse

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cystinose

Lysosomes

Mots clés libres

PQLC2

Transporteur lysosomal

Acides aminés cationiques

Cystinose

Électrophysiologie

Ovocyte de Xénope

Famille PQ-loop

Asymétries

Bioinformatique

PQLC2

Lysosomal transporter

Cationic amino acids

Cystinosis

Électrophysiology

Xenopus oocyte

PQ-loop family

Asymmetry

Bioinformatic

Résumé

Le transport de composés à travers les membranes biologiques est crucial pour la physiologie des cellules eucaryotes. Cependant la fonction de nombreux transporteurs putatifs reste inconnue. C’est notamment le cas de nombreux transporteurs intracellulaires exportant les catabolites du lysosome. Le transporteur lysosomal de cystine, baptisé cystinosine, se caractérise par la présence d’un motif dupliqué appelé " boucle PQ ". Sa dysfonction entraîne une maladie lysosomale, la cystinose, caractérisée par l'accumulation de cystine dans les lysosomes. Les protéines possédant un motif PQ sont retrouvées plus souvent dans les cellules eucaryotes et, à l'exception de la cystinosine, leur fonction reste inconnue. Dans cette thèse, nous démontrons qu'une autre protéine à motif PQ, PQLC2 est le transporteur responsable de l'efflux lysosomal des acides aminés cationiques et qu'il est impliqué dans le traitement de la cystinose.L'hypothèse de départ était basée, d'une part, par sur des prédictions par analyse protéomique de la localisation lysosomale de PQLC2 et, d'autre part, sur des résultats chez S.cerevisiae impliquant les orthologues putatifs de PQLC2, situés à la membrane de la vacuole, dans l'homéostasie des acides aminés cationiques. En utilisant une approche consistant à délocaliser PQLC2 à la membrane plasmique et à acidifier le pH extracellulaire pour mimer la lumière acide du lysosome, nous avons pu, par mesure d'accumulation intracellulaire de composés radiomarqués et par mesure électrophysiologique sur cellule entière, faire la preuve du transport sélectif, actif à bas pH et de faible affinité des acides aminés cationiques par PQLC2. Dans une seconde partie, nous avons mis en évidence l'implication de ce transporteur dans l'efflux lysosomal du produit de réaction entre la cystine accumulée dans les lysosomes de cellules de patients cystinotiques et le principe actif (cystéamine) du traitement pharmacologique de la cystinose.Enfin, dans une dernière partie, nous avons effectué une analyse bioinformatique préliminaire des protéines à motif PQ qui exploitait la pseudo-symétrie de ces protéines pour identifier des résidus potentiellement impliqués dans l'activité de transport.

Transport of solutes across biological membranes is crucial to eukaryotic cell physiology. However, the function of many putative transporters remains unknown, such as the proteins responsible for lysosomal export of metabolites. Cystinosin, the lysosomal cystine exporter defective in cystinosis, is characterized by a duplicated motif termed the PQ loop. PQ-loop proteins are more frequent in eukaryotes than in prokaryotes, and, except for cystinosin, their molecular function remains unknown. Here we show that another PQ-loop protein, PQLC2, is a lysosomal transporter for cationic amino acids and that it is required for the treatment of cystinosis. The hypothesis that PQLC2 is a lysosomal metabolite transporter was based on a proteomic study predicting that PQLC2 is located at the lysosomal membrane and on a genetic study that linked putative yeast orthologues with cationic amino acid homeostasis. Using an approach that consisted in misrouting PQLC2 to the plasma membrane of frog oocytes and in acidifying the extracellular medium to mimic the acidic lysosomal lumen, we showed an accumulation of radiolabelled cationic amino acids into mRNA-injected oocytes and an electrogenic, inward current due to a selective, pH-dependent, low-affinity transport of cationic amino acids by PQLC2. Moreoever, we showed that PQLC2 exports a key chemical intermediate (cysteamine-cysteine mixed disulfide) from cystinotic lysosomes treated with the aminothiol drug cysteamine, thus explaining the mechanism underlying the current drug therapy of cystinosis. Finally, in a last chapter, we performed a preliminary bioinformatic study of the family of PQ-loop proteins that took advantage of the pseudo-symmetric structure of these proteins to identify residues potentially important for the transport activity.