Mécanismes de sécrétion d'ATP et d'exposition de la calréticuline au cours d'une chimiothérapie immunogène

Molecular Mechanisms of ATP Secretion and Calreticulin Exposure During Immunogenic Cell Death

• Auteur / Autrice : Yidan Wang
• Direction : Guido Kroemer
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 19/09/2014
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé (2000-2015 ; Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Métabolisme, cancer et immunité (Villejuif, Val-de-Marne)
• Jury : Président / Présidente : Jean-Marc Cavaillon
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guido Kroemer, Jean-Marc Cavaillon, Eric Tartour, Mojgan Djavaheri-Mergny, Jérôme Galon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Tartour, Mojgan Djavaheri-Mergny

Mots clés

Mots clés contrôlés

Autophagie

Interleukine 8

Calréticulines

ATP

Mots clés libres

ATP

Anthracycline

Pannexine 1 (PANX1)

LAMP1

Autophagie

Calréticuline (CRT)

CXCL8

Stress du réticulum endoplasmique (RE)

ATP

Anthracycline

Pannexin 1 (PANX1),

LAMP1

Autophagy

Calreticulin (CRT

CXCL8

ER stress

Résumé

Pendant très longtemps, les traitements contre les cancers se sont basés sur la cytotoxicité des chimiothérapies, sur leur capacité à tuer directement les cellules malignes ou à induire leur senescence. Mais cette cytotoxicité accrue et non ciblée a également pour effet de tuer les cellules du système immunitaire du patient. Cependant, il a été montré que la radiothérapie, les anthracyclines ainsi que l’oxaliplatine étaient capables d’induire une apoptose décrite comme étant une mort cellulaire immunogène. De ce fait, les cellules tumorales mourantes agiront comme vaccin thérapeutique.La mort cellulaire immunogène se caractérise par trois grands marqueurs : un stress du réticulum endoplasmique pré-mortem qui va induire la translocation de la calréticuline de la lumière du réticulum endoplasmique vers la surface cellulaire, la libération d’ATP dans le milieu extracellulaire permettant le recrutement des cellules dendritiques et l’activation de l’inflammasome NLRP3 via le récepteur P2RX7, et enfin la libération de la protéine HMGB1 dans le milieu extracellulaire, qui va aller interagir avec TLR4 à la surface des cellules dendritiques pour stimuler leur fonction présentatrice d’antigène. La première partie de ce travail a consisté à comprendre les mécanismes moléculaires précis par lesquels l’ATP est sécrétée activement lors d’une mort cellulaire immunogène. En utilisant une combinaison de techniques impliquant des criblages pharmacologiques, des techniques de monitorage de la localisation intracellulaire de l’ATP entre autres, nous avons montré qu’après un traitement par les inducteurs de la mort immunogène, l’ATP était redistribué des lysosomes aux autolysosomes et que sa sécrétion requiert la protéine lysosomale LAMP1. Nous avons également montré qu’il existait d’autres voies de libération d’ATP telles que la voie de signalisation Rho, et également l’ouverture des hémicanaux pannexine 1 (PANX1). De façon surprenante, nous avons observé une implication de PANX1 dans la translocation de LAMP1 à la surface cellulaire. Ces résultats ont permis de comprendre un peu plus précisément les mécanismes de sécrétion d’ATP dans la mort cellulaire immunogène, mettant en évidence l’importance de l’exocytose lysosomale caspases dépendante et PANX1 dépendante.La seconde partie de ce travail s’est portée sur l’étude d’une autre caractéristique de la mort cellulaire immunogène, à savoir l’exposition de la calréticuline à la surface cellulaire. En partant du constat qu’après un traitement par la mitoxantrone, la calréticuline était relocalisée en périphérie à la fois dans les cellules humaines et les cellules de levure, il a été suggéré que la voie d’exposition de la calréticuline était conservée phylogénétiquement. Nous avons montré que les phéromones pouvaient agir comme inducteurs physiologiques de l’exposition de la calréticuline dans les cellules de levure. Un criblage d’ARN interférant et des analyses de transcriptome nous ont permis de montré que les chimiokines, en particulier CXCL8 chez l’humain (appelé également interleukine-8) et son orthologue Cxcl2 chez la souris étaient impliquées dans la translocation de la calréticuline à la surface cellulaire. En traitant les cellules cancéreuses par la mitoxantrone, nous observons une production de CXCL8 par les cellules cancéreuses humaines in vitro et de Cxcl2 par les cellules cancéreuses murines in vivo. Un « knockdown » des récepteurs pour CXCL8/Cxcl2 réduit de manière significative l’exposition de la calréticuline à la surface cellulaire. Ces résultats ont donc montré l’importance des chimiokines dans la voie d’exposition de la calréticuline.L’ensemble de ce travail a permis de comprendre plus en détails deux des trois grandes caractéristiques de la mort cellulaire immunogène.

Cytotoxic anti-neoplastic agents were considered for a long time to mediate their therapeutic effects via their capacity to directly kill malignant cells. Nevertheless, this high cytotoxicity is non-targeted and will eventually diminish immune cells. During the last years, it has been shown that radiotherapy and some anticancer agents, such as anthracyclines and oxaliplatin, can stimulate actively anti-tumor immune responses. In fact, they can induce an immunogenic type of apoptosis, which we termed immunogenic cell death (ICD). Thereby, dying cells can act as therapeutic vaccine against residual cancer cells that overcame the initial treatment.ICD is characterized by three major hallmarks: a pre-mortem stress of the endoplasmic reticulum (ER), which triggers the translocation of the ER chaperone protein called calreticulin (CRT) to the cell surface, the secretion of ATP from apoptotic cells, which acts as a signal for the recruitment of dendritic cells and for the activation of the NLRP3 inflammasome via its receptor P2RX7, and the release of HMGB1 into the extracellular space, allowing it to interact with TLR4 and thus stimulate the antigen-presenting functions of the DCs.The first part of my work focused on the precise molecular mechanisms by which ATP is actively secreted during ICD. Using a large panel of techniques, including chemical compounds screens and monitoring the subcellular localization of ATP, we showed that following treatment of various tumor cells with ICD inducers, ATP is redistributed from lysosomes to autolysosomes and the lysosomal protein LAMP1 is required for active ATP secretion. We also showed that Rho and pannexin 1 (PANX1) are indispensable for efficient ATP release in response to ICD inducers. Surprisingly, we observed an unexpected link between PANX1 and the exposure of LAMP1 at the cell surface. These results will help to understand the mechanisms necessary for ATP secretion during ICD.In the second part of this work we further studied the surface exposure of CRT during ICD. We observed that mitoxantrone (MTX), which belongs to the group of anthracyclines, can induce a peripheral relocalisation of CRT, both in human cells and yeast cells. In addition, we showed that pheromones can act as a physiological inducer of CRT translocation in yeast. Focused siRNA screening combined with transcriptome analyses revealed that human CXCL8 (also called interleukin-8) and its mouse ortholog Cxcl2 play an essential role in the translocation of CRT to the cell surface. Interestingly, MTX-treated human cancer cells displayed an elevated production of CXCL8 in vitro. These results were confirmed in vivo, with MTX treated murine tumors, which also displayed elevated Cxcl2 levels. The MTX-induced CRT exposure was significantly reduced when we performed a knockdown of CXCL8/Cxcl2 receptors. Altogether, these results showed the importance of chemokine signaling circuitries in immunogenic CRT exposure.This work allows for the detailed understanding of the mechanisms of ICD and might thus be useful for further targeted drug development.