Etude de la structure de la petite protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B

Study of Hepatitis B Virus small envelope protein structure

• Auteur / Autrice : Alexandra Desrames
• Direction : Camille Sureau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Virion

Protéines de l'enveloppe virale

Virus de l'hépatite B

Antigènes de surface du virus de l'hépatite B

Pénétration virale

Résumé

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV) reste un problème de santé publique majeure à l'échelle mondiale puisqu'elle touche près de 300 millions d'individus. Le HBV est un virus à ADN de la famille des Hepadnaviridae, dont l'enveloppe du virion est composée de lipides d'origine cellulaire et de glycoprotéines transmembranaires de trois types, S-, M- et L-AgHBs. La protéine S- AgHBs, majoritaire dans l'enveloppe virale, est l'élément moteur de l'assemblage, et elle porte dans le domaine exposé à la surface des particules virales, un déterminant immunodominant appelé ''déterminant- a'' contre lequel la majorité des anticorps neutralisants sont dirigés. Ce déterminant antigénique est intimement associé à un déterminant du caractère infectieux qui assure l'interaction avec les sulfates d'héparane à l'étape initiale d'entrée. A ce jour, nous possédons très peu d'information sur la structure de la boucle antigénique (BAG) de la protéine S-AgHBs qui sous-tend le caractère antigénique et fonctionnel d'entrée virale. L'objectif du travail de thèse était d'obtenir des informations sur l'organisation tridimensionnelle du polypeptide BAG, afin de mieux comprendre son rôle à l'étape d'entrée virale. La première étape a été de déterminer la sous-unité minimale de l'enveloppe des particules virales, qui porte le déterminant-a, en utilisant une série d'anticorps monoclonaux spécifiques de ce déterminant. Nous avons montré que la plupart des anticorps étaient bien spécifiques d'épitopes conformationnels, qu'ils étaient neutralisants, et qu'ils réagissaient avec des formes dimériques de protéines S-AgHBs. La majorité des épitopes du déterminant-a sont donc présents sur des dimères de protéines S-AgHBs solubles. De plus, nous avons mis en évidence la présence de deux isoformes de dimères à la surface des particules virales, que nous pouvons distinguer par leur comportement électrophorétique en gel SDS et par leur réactivité avec les anticorps monoclonaux. Nous pensons que les deux isoformes de protéines S-AgHBs correspondent à deux combinaisons de ponts disulfures inter- ou intra-chaînes entre les nombreux résidus cystéine de la BAG. Dans le but d'obtenir des préparations homogènes et pures de dimères de protéines S-AgHBs comme substrat de cristallisation, nous avons suivi plusieurs stratégies : la production de la protéine S- AgHBs par traduction in vitro, la production dans Escherichia coli, et la purification de particules virales à partir de surnageant de culture de cellules Huh-7 ou de plasmas infectieux. La stratégie de purification de particules produites en culture de cellules Huh-7 est apparue la plus fiable en termes de qualité et rendement, et la plus adaptée à l'analyse de mutants de la protéine S-AgHBs.

Chronic infection with the hepatitis B virus (HBV) represents a major public health concern worldwide because an estimated 300 million individuals are affected. HBV is the prototype of the Hepadnaviridae family, a DNA virus with an envelope consisting of cell derived lipids associated to three types of transmembrane glycoproteins: S-, M- et L-HBsAg. S-HBsAg, the most abundant in the viral envelope, is the driving force of viral particle assembly, but it also bears in its ectodomain, an immunodominant determinant, referred to as the a-determinant, against which most of the neutralizing antibodies are directed. This antigenic determinant is also closely associated to an infectivity determinant responsible for interacting with cell surface heparan sulfate at the initial step of viral entry. As of today, we have little information on the structure of the antigenic loop (AGL) of the S-HBsAg protein that underlies the antigenic and function at viral entry. The aim of this thesis project was to gather information on the three dimensional organization of the AGL polypeptide, for a better understanding of its function at viral entry. The first step of the study was to identify the minimum subunit of the viral envelope, which bears the a-determinant. This was achieved using a panel of monoclonal antibodies that are specific for the a-determinant. We have shown most of the antibodies were: i) directed to conformational epitopes, ii) neutralizing, and iii) reactive with the dimeric forms of S-HBsAg. We concluded that most of a-determinant epitopes are conserved on the soluble dimeric forms of S-HBsAg. Furthermore, we demonstrate the presence in the HBV envelope, of two isomers of S- HBsAg dimers, which can be separated by SDS-PAGE and identified by isomer-specific antibodies. We propose that the two isomers correspond to two distinct networks of disulfide bonds between the numerous AGL cystein residues. In an effort to obtain pure and homogenous preparations of S-HBsAg dimers, as substrate for crystallization, we adopted several strategies: i) production of S-HBsAg by in vitro translation, ii) production in E. Coli, and iii) the purification of viral particles from transfected Huh-7 cell culture medium or from infectious plasmas. The purification of S-HBsAg dimers from cell culture-derived particles clearly appeared as the strategy of choice, in terms quality and yield, and flexibility of the approach in case of S- HBsAg mutants analysis.