Design of multi-chain chimeric antigen receptors and their vectorization by nuclease mediated homologous gene targeting

• Auteur / Autrice : Justin Eyquem
• Direction : Julianne Smith
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : [Biomolécules, Biologie Structurale, Pathologies, Biothérapies]
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Endonucleases

Immunothérapie anticancéreuse

Ciblage de gène

Expression des gènes

Génie génétique

Résumé

L'immunothérapie adoptive implique le transfert de lymphocytes T spécifiques à un antigène générés ex vivo et est une stratégie prometteuse pour traiter le cancer. Le protocole consiste en la transduction par vecteur viraux de gène codant pour un TCR spécifique d'un antigène tumoral ou un CAR. Les CARs sont des récepteurs artificiels permettant l'activation de lymphocytes T indépendamment du CMH. J'ai étudie�� la conception de CARs multimériques (mcCAR) basé sur la structure du FcsRl. Quand co-cultivées avec des cellules tumorales, les lymphocytes T exprimant un mcCAR ont montrées une activité cytotoxique spécifique. Bien que d'autres expériences soient nécessaires pour apprécier leur potentiel, cela reste le premier exemple d'un mcCAR capable de déclencher l'activation des cellules T. Puis, j'ai étudié des méthodes de vectorisation alternatives. Ce projet a porté sur la caractérisation de loci et la conception de cassettes d'intégration permettant l'expression d'un transgène en conjonction avec une manipulation minimale du génome. J'ai évalué trois loci pour l'intégration de gènes induite par des nucléases. Un gène rapporteur sous le contrôle de différents promoteurs a été intégré à chaque locus dans les deux orientations. Une expression stable a été obtenue dans les trois loci sans perturber l'expression de gènes endogènes. Les intégrations ciblées en simple copie permettent une expression du transgène plus stable que les multicopies. Enfin, nous avons développé une approche permettant l'intégration par nucléase d'un transgène sous le contrôle d'un promoteur endogène. Ainsi, seuls les clones ayant une intégration ciblée expriment le transgène facilitant leur sélection.

Adoptive immunotherapy, which involves the transfer of antigen-specific T cells generated ex vivo, is one of the most promising new strategies to treat cancer. The current protocol involves the transduction of T cells with a retroviral vector encoding tumor specific TCRs or CARs. CARs are recombinant receptors providing both T-cell-activating function in an MHC-independent manner. First, I have designed new CAR architectures for higher modularity. The aim of this project was the first proof of concept of multi-chain CARs (mcCAR) based on the FccRI. When co-cultivated with tumor cells, T cells expressing mcCARs were able to promote specific cytotoxicity. Although further experiments are needed to fully appreciate the potential of this new architecture, this remains the first example of a mcCAR capable of specifically triggering T cell activation. Then, I have studied alternative vectorization methods. This project focused on the characterization of loci and the design of integration cassettes to promote robust transgene expression with minimal manipulation of genome. We evaluated three loci from different genomic environment for nuclease mediated gene targeting. Reporter genes controlled by different promoters were inserted at in senne and antisense orientations. Sustainable expression was achieved at all loci without disturbance of flanking gene expression. Single targeted integrations exhibited improved transgene expression stability versus multicopy. Finally, we developed nuclease mediated promoter trap approach allowing the fast selection of clones carrying single targeted integration which stably express a transgene without disturbing the endogenous gene expression.