Optimisation d'un procédé de culture d'épiderme autologue : influence d'un feeder humanisé et d'une faible tension d'oxygène

• Auteur / Autrice : Cédric Thepenier
• Direction : Jean-Jacques Lataillade
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance en 2014
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cellules cultivées

Ingénierie tissulaire

chirurgie

Brûlures

Transplantation autologue

Cellules souches mésenchymateuses

Résumé

Notre objectif général est l'amélioration de la technique de culture d'épiderme autologue pour le traitement des grands brûlés. Pour cela nous avons rapproché de la physiologie cutanée les conditions de culture de kératinocytes primaires humains en prenant en compte le taux d'oxygène. D'autre part nous testé l'effet que ce paramètre produisait sur la croissance des kératinocytes cultivés sur cellules nouricières murines (méthode de Green) et sur leur remplacement par des cellules nourricières humaines dans l'éventualité d'une interdiction des produits xénogéniques au sein des greffons. Nous avons pu montrer tout d'abord que la densité optimale de cellules nourricières murines dépendait de la P02, et qu'une densité optimale pour une P02 de 20% pouvait s'avérer inhibitrice à 3%. A leurs densités de feeder optimales, les cultures à basse concentration d'02 (3%) ont montré un rendement 4,2 fois supérieur à ce qu'il est à 20% pour un même jour d'arrêt de culture. Cette augmentation de prolifération est un effet stable sur plusieurs passages, et s'accompagne d'une augmentation de la clonogénicité sur les passages tardifs. Pour les cultures issues de certains donneurs, abortives dans les conditions usuelles de culture (20% de p02), une basse concentration d'02 a par ailleurs rendu la culture possible sur un plus grand nombre de passage, montrant que cet effet ne se produit pas au détriment de la capacité d'autorenouvellement de la population. Enfin, les kératinocytes issus de cette modification de la méthode classique de culture conservent leur potentiel à engendrer un épiderme in vivo sur souris NOD/SCID. Par ailleurs, l'augmentation de prolifération a également pu être observée sur deux sources de cellules nourricières humaines, des cellules stromales mésenchymateuses de moelle et des fibroblastes dermiques. La capacité à engendrer un épiderme différencié in vivo après culture sur cellules humaines en hypoxie est là aussi maintenue. Enfin, il semble que cet effet d'une basse concentration d'oxygène passe par plusieurs mécanismes : directs, la prolifération de kératinocytes de lignées HaCat sans cellules nourricières étant augmentée pour une P02 à 3%; et indirects, le milieu conditionné par des cellules nourricières murines à 3% de p02 ayant plus d'effet sur la prolifération que celui issu de 20%. Ces résultats préliminaires sont en faveur d'une modification du protocole de culture d'épiderme utilisé en clinique depuis 1981 par la culture à basse concentration d'oxygène. Les bénéfices attendus pour le patient, outre la réduction du délai de culture, portent sur le sauvetage de cultures abortives et sur l'apport de kératinocytes moins différenciés, paramètre associé à une réduction de l'évolution vers la fibrose cutanée sur des modèles murins.

To enhance the production conditions for cultured epidermal autografts (CEA) for large burns, we sought to study the in vitro effect of a low oxygen level on epidermal growth. We tested this parameter on CEA grown on murin feeder cells (Green's method) as well as human feeder cells. We first could evidence that the optimal feeder density depended on the oxygen level. A feeder density made optimal at 20% 02 could prove inhibitory on keratinocyte growth at 3% 02. At their respective best feeder densities, low oxygen level (3%) led to an average 4,2 fold increase in keratinocyte yield for a same arrest day as compared with 20% culture. This effect proved to be stable on several successive passagings, showing the increase in proliferation did not take place at the expense of tell self renewal. Keratinocytes grown at a low oxygen level kept their ability to form a stratifying epidermis on an in vivo NOD/SCID mouse excisional model. In parallel, the increase in proliferation was also observed when keratinocytes were cultured on human feeder cells, bone marrow mesenchymal stroma' cells and dermal fibroblasts. This effect of a low oxygen tension on keratinocytes appears to be partly direct, as the growth rate of HaCat feederless keratinocytes was enhanced at 3% vs 20% 02. It is also partly an indirect effect, as conditioned medium from murin feeder cells cultured in hypoxia has a more pronounced positive effect on keratinocyte growth than its normoxic counterpart. These preliminary resuits could lead to the modification on the culture protocol currently in use for the majority of CEA grafts for large burns. The expected benefits for the patients, beyond slightly shortening culture time, would include salvaging abortive cultures and bringing less differentiated keratinocytes, a parameter linked with a decrease in fibrotic evolution on murin models.