Identification de métabolites secondaires des plantes, protecteurs des photorécepteurs à cônes pour le traitement de la rétinopathie pigmentaire

Identification of cone protecting molecules from natural compounds libraries that can preserve central vision in patient suffering from retinitis pigmentosa

• Auteur / Autrice : Alexandra Lyor Bouaziz
• Direction : Thierry Léveillard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 29/09/2014
• Etablissement(s) : Paris 6
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cerveau, cognition, comportement (Paris ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de la vision (Paris ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Dusart
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Litaudon, Franck Himbert, Eric Duplus
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Dominique Mattar, Julien Dairou

Mots clés

Mots clés contrôlés

Apoptose

Cellules à cône

Photorécepteurs (cellules) de la rétine

ARN interférence

Thérapeutique

Rétinite pigmentaire

Transcriptome

Biomolécules actives végétales

Emploi en thérapeutique

Annonacées

Mots clés libres

Uvaria Chamae

Culture enrichie en cônes

Criblage à haut contenu d'une extraithèque

Fractionnement bioguidé

Rétinite pigmentaire

RP-HPLC

PFKFB2

Culture enrichie en cônes

Transcriptomique

Effet Warburg

Dead/life

Glycolyse aérobie

GLUT1

Purification

Uvaria Chamae

Retinitis pigmentosa (RP)

Rod-derived cone viability factor (RdCVF)

High content screening

Traditional medicine

Bioguided fractionation

Annonaceae

Primary chicken cone cultures

Warburg effect

Cell survival

Quasi-industrial scale

RP-HPLC

GLUT1

Scale up

Résumé

La rétinopathie pigmentaire est une maladie héréditaire qui se caractérise par la mort des photorécepteurs à bâtonnet suivie des photorécepteurs à cône, dont l'issue finale est la cécité. Du fait du caractère séquentiel de la pathologie, mon laboratoire a démontré grâce à un criblage à haut contenu d’ADNc de rétine neurale de souris sur des cultures enrichies en cône, l’existence d’une protéine trophique : le facteur trophique Rod derived Cone Viability Factor (RdCVF). Celui-ci est sécrété par les bâtonnets et protège les cônes. Nous avons mis à profit la technologie de criblage à haut contenu sur les cultures primaires enrichies en cônes ayant conduit à l’identification de RdCVF, afin d'identifier parmi une large collection d’extraits de plantes utilisées en médecine traditionnelle des métabolites secondaires ayant la capacité de promouvoir la survie des cônes. Ceux-ci serviraient à développer une seconde génération d’agents thérapeutiques pour le traitement de la RP. Le criblage de 800 extraits a conduit à l’identification de 30 plantes ayant une activité protectrice des cônes. Nous nous sommes concentrés sur les métabolites secondaires des feuilles d’une annonacée, Uvaria chamae, une plante médicinale originaire du Burkina Faso qui présentait une activité de survie robuste. Le fractionnement bioguidé de 5 kg d’extrait de feuilles d’Uvaria chamae a permis la production de 140 µg d’une fraction ayant une activité spécifique très élevée sur la survie et la morphologie des cônes. Cette quantité de matière étant jugée insuffisante pour caractériser la(es) molécule(s) active(s), nous avons réitéré le processus de purification à partir de 100 kg, ce qui a nécessité plusieurs étapes quasi industrielles compte tenu de la quantité de matière traitée. L’activité de survie et le maintien du caractère différencié des cônes ont été validés sur ce second fractionnement. Des étapes successives de purification et d'optimisation d'une fraction insoluble ont permis d’obtenir deux sous-fractions actives dont l’une présente un dégré de pureté élevé de 99,8 %. La caractérisation RMN de cette sous-fraction est d'ores et déjà en cours. Ces molécules actives seront ensuite validées chez la souris modèle de la pathologie rétinienne avant d’initier des études précliniques. À l’aide des fractions les plus actives, et en profitant des outils développés pour l’étude des mécanismes d’action du facteur trophique RdCVF, nous avons pu montrer que l’extrait d’Uvaria chamae induit la survie des cônes en stimulant la glycolyse aérobie, aussi connue sous le nom d’effet Warburg. Cet effet ne repose pas sur le récepteur de surface de RdCVF qui active l’effet Warburg par stimulation de l’entrée du glucose à travers un de ses transporteurs, GLUT1. La(es) molécule(s) ne sont pas des molécules agonistes du récepteur de RdCVF. Il semble que l’entrée du glucose et l’effet Warburg soient stimulés par Uvaria chamae par interaction avec une cible intracellulaire. À l’aide de données transcriptomiques, nous avons pu mettre en évidence l’expression spécifique par les photorécepteurs d’une enzyme de la famille des 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatases, PFKFB2 qui produit un activateur allostérique de la glycolyse. Les études par ARN interférence en cours devraient permettre de valider cette cible et ainsi identifier les points de convergence entre le facteur de survie RdCVF et les métabolites secondaires des extraits de feuilles d’Uvaria chamae.

More than 57 genes are responsible for retinitis pigmentosa (RP), the most common inherited retinal degeneration, are selectively expressed by rods. In most mammals, including humans, rods represent 95% of photoreceptors whereas the remaining 5% are cones. Rods have a minor role in vision which depends mainly on cone photoreceptors. It is unknown why cones degenerate after rods in a second step in this incurable blinding disease. The gene NXNL1 encodes for a cone survival factor, RdCVF and also by alternative splicing, for a thioredoxin protein, RdCVFL. Those proteins are selectively expressed by photoreceptors. RdCVF is secreted by rods and protects the cones and their function by activating a receptor on their surface. A mutation causing a rod death in RP results in a significant reduction in retinal concentration of RdCVF. Consequently, cones are no longer protected and therefore degenerate. Administration of RdCVF could invert cone degeneration by maintaining central vision in patients suffering of RP, regardless of a causative gene. RdCVF was identified by the technology of high content screening on primary chicken cone cultures. In order to identify secondary metabolites having the ability to promote cone survival, we test on the same system a collection of plants extracts used in traditional medicine. Our findings would serve to develop a second generation of therapeutic agents for the treatment of RP. The screening of 800 extracts has led us to identify 30 plants having a possible protective activity on cones. We focused on secondary metabolites extracted from Uvaria chamae leaves, belonging to the Annonaceae family and demonstrated its strong promoting activity on cone survival. The bioguided fractionation of 5 kg of leaves extracted from Uvaria chamae allowed, after six purification steps including four reverse phase chromatography rounds (RP-HPLC), the production of 140 micrograms.This fraction was shown to possess a high specific activity. Since the material amount is not sufficient to characterize actives molecules, we repeated the same purification process starting from 100 kg of Uvaria chamae leaves that were harvested specifically for this project during the rainy season in Burkina Faso. The second fractionation was carried out by a quasi-industrial scale, given a proper amount of material that enabled us to study the activity on cone survival. After four successful consecutive purification steps, we are able to purify and to characterize the active molecules which will be then validated in a mouse model of RP before initiating preclinical studies. Using the most active fractions, we have shown that the Uvaria chamae extract induced cone survival by stimulating aerobic glycolysis, also known as the Warburg effect. This has also been validated for the second species of the same family Annona senegalensis, issued from the screening. This effect does not depend on the RdCVF surface receptor that activates the Warburg effect by stimulation of glucose uptake through one of its transporters, GLUT1. These molecules are not agonists of RdCVF and do not interact with the same receptor of RdCVF. It seems that the glucose uptake and the Warburg effect, stimulated by the Uvaria chamae molecules, depend on an intracellular target. Using transcriptomic data, we were able to highlight specific expression by photoreceptors of an enzyme belonging to the family of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 2, PFKFB2, which produces an allosteric glycolysis activator. RNA interference studies will enable to validate this target and to identify common points between the trophic factor RdCVF and the secondary metabolite extracts from Uvaria chamae leaves.