Approche génomique et bioinformatique de l'émergence et de la diffusion des résistances chez Plasmodium au Cambodge

par Nimol Khim

Thèse de doctorat en Microbiologie / Parasitologie

Sous la direction de Didier Ménard et de Emmanuel Cornillot.

Soutenue le 10-12-2014

à Montpellier 1 , dans le cadre de Systèmes Intégrés en Biologie, Agronomie, Géosciences, Hydrosciences, Environnement (Montpellier ; École Doctorale ; 2009-2015) , en partenariat avec Institut Pasteur du Cambodge (Phnom-Penh) (laboratoire) et de Institut Pasteur du Cambodge (laboratoire) .

Le jury était composé de Didier Ménard, Emmanuel Cornillot, Didier Fontenille, Pascal Millet.

Les rapporteurs étaient Christophe Rogier, Hubert Barennes.


  • Résumé

    Le paludisme, maladie parasitaire et vectorielle, sévissant principalement dans les zones intertropicales où vit près de 40% de la population mondiale, reste un problème majeur en santé publique. Les cinq espèces de Plasmodium connues infectées le paludisme chez l'homme sont présentes au Cambodge, qui est reconnu comme l'épicentre de l'émergence de souches de P. falciparum multi-résistantes (chloroquine, sulfadoxine- pyriméthamine, méfloquine, artémisinine), pouvant entraver les progrès accomplis depuis plus d'une décennie. Le travail de thèse intitulé « Approche génomique et bio-informatique de l'émergence et de la diffusion des résistances chez Plasmodium au Cambodge » avait pour objectif de développer de nouveaux outils moléculaires et biologiques pour 1) une meilleure compréhension de l'impact des stratégies mises en place pour lutter contre le paludisme à P. falciparum sur les autres espèces de Plasmodium, 2) la mise en place d'outils biologique et moléculaire, permettant de mieux définir l'épidémiologie des parasites résistants, en particulier la résistance à la quinine et aux dérivés de l'artémisinine, 3) l'étude et la définition des sous-populations parasitaires circulant au Cambodge afin d'estimer les risques associés à la diffusion de la résistance à l'artémisinine. Cette thèse a été réalisée dans l'Unité d'Epidémiologie Moléculaire du Paludisme à l'Institut Pasteur du Cambodge (IPC) sous la codirection du Dr. Didier Ménard (Chef de laboratoire à l'IP) et du Pr. Emmanuel Cornillot (Professeur à l'Université Montpellier I). Le premier objectif visait à étudier l'impact de la pression médicamenteuse sur la dynamique d'évolution des populations parasitaires. Nous avons d'abord évalué le polymorphisme des gènes associés à la résistance à la pyriméthamine (gène dhfr, dihydrofolate reductase) chez Plasmodium malariae et Plasmodium ovale (article 1 et manuscrit en préparation1), et le polymorphisme du gène mdr-1 (multidrug resistance 1) associé à la résistance à la mefloquine chez P. vivax (article 2). De plus, en collaboration avec l'Institut Pasteur de Madagascar, nous avons étudié le lien pouvant exister entre le polymorphisme du gène candidat Plasmodium falciparum Na+/H+ exchanger (Pfnhe-1) et la résistance (clinique et in vitro) de P. falciparum à la quinine (articles 3 et 4).Le deuxième objectif s'est interessé au développement d'outils biologiques et moléculaires permettant d'évaluer la résistance des souches de P. falciparum aux dérivés de l'artémisinine. Les 3 articles présentés (articles 5, 6 et 7) decrivent la méthodologie d'approche originale utilisée associant la génomique, la biologie, la clinique et l'épidémiologie, qui a permis d'aboutir à la découverte d'un marqueur moléculaire (mutations au sein du gène Kelch 13) fiable pour identifier les souches résistantes aux dérivés de l'artémisinine.Le dernier objectif était consacré au développement de la technique PCR-LDR-FMA appliqué à la détection d'un panel de 24 SNPs permettant de caractériser par un « barcode » chaque isolat de P. falciparum. Cette technique couplée avec une analyse bio-informatique et statistique des données nous a permis d'étudier et de définir la structuration des populations parasitaires circulant au Cambodge afin d'estimer les zones à risque de diffusion de la résistance à l'artémisinine (manuscrit en préparation 2).A travers ce travail de thèse, nous nous sommes efforcés de montrer la puissance des techniques de biologie moléculaire disponibles couplées avec des approches génomique et bio-informatique pour améliorer notre compréhension de la dynamique d'évolution des populations parasitaires. Ce travail s'est essentiellement concentré sur les phénomènes liés à l'émergence et de la diffusion des parasites résistants aux antipaludiques, le but final de ce travail étant d'améliorer les stratégies de lutte mises en place pour atteindre l'ambitieux objectif d'élimination du paludisme.

  • Titre traduit

    Genomics and Bioinformatics in the emergence and spread of resistant Plasmodium in Cambodia


  • Résumé

    Malaria, a protozoan vector-borne disease, is mainly prevalent in tropical areas, where nearly 40% of the world population is residing and remains one of the most concerns for public health worldwide. In Cambodia, the five Plasmodium species known to cause malaria in humans are present. The main feature of this country is that it is recognized as the epicenter of the emergence of multi-resistant P. falciparum parasites (to chloroquine, sulfadoxine-pyrimethamine, mefloquine, and artemisinin), a very significant menace to public health in the Mekong region that could impact the worldwide strategy to fight malaria. The thesis presented here, entitled “Genomics and Bioinformatics in the emergence and spread of resistant Plasmodium in Cambodia” aimed to develop new molecular and biological tools for:1) improving our understanding of the collateral impact of the strategies implemented to fight against falciparum malaria on the other Plasmodium species; 2) defining the molecular epidemiology of antimalarial resistant parasites, especially resistance to quinine and artemisinin derivatives;3) studying and defining the structure of P. falciparum parasite populations circulating in Cambodia to estimate areas at risk of spread of artemisinin resistance, using genomic approaches and bioinformatics. This thesis was carried out in the Malaria Molecular Epidemiology Unit at Pasteur Institute in Cambodia (IPC) under the co-direction of Dr. Didier Ménard (Head of the Unit, IP) and Pr. Emmanuel Cornillot (Professor, University of Montpellier I). The first objective of this work was to study the impact of drug used to treat falciparum malaria on the dynamics of other Plasmodium species. In a first step, we evaluated the polymorphism in gene associated to pyrimethamine resistance (dhfr gene, dihydrofolate reductase) in Plasmodium malariae and in Plasmodium ovale (article 1 and manuscript in preparation 1) and the polymorphism in mdr-1 gene (multidrug resistance 1 gene) associated to mefloquine resistance in P. vivax (article 2). Secondly, in collaboration with Pasteur Institute in Madagascar, we investigated the association between the polymorphism in Plasmodium falciparum Na + / H + exchanger gene (Pfnhe-1) and quinine resistance defined either by clinical or in vitro phenotypes (articles 3 and 4). The second objective was focused on the development of novel biological and molecular tools to assess the resistance of P. falciparum to artemisinin derivatives. The three papers presented (articles 5, 6 and 7) describe an original approach combining genomics, biological, clinical and epidemiological studies, which lead to the discovery of a molecular marker (mutations Kelch 13 gene) associated to artemisinin resistance.The third and final objective was devoted to the development of the PCR-LDR-FMA technology applied to the detection of a panel of 24 SNPs to characterize a "barcode" of P. falciparum isolates. This technic coupled with bioinformatics and statistical analysis allowed us to study and define the structure of the parasite populations circulating in Cambodia for estimating areas at risk of spread of artemisinin resistance (manuscript in preparation 2). Through this work, we have tried to show the usefulness of available molecular biology methods coupled with genomic and bioinformatics approaches to improve our understanding of the dynamics of the malaria parasite populations. This work has been mainly focused on the emergence and spread of antimalarial resistant parasites, keeping in mind that the ultimate goal of this work was to improve strategies implemented to achieve the ambitious goal of malaria elimination.


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