Ingénierie métabolique de Clostridium acetobutylicum pour la production d'isopropanol

Metabolic engineering of C. acetobutylicum for the production of isopropanol

• Auteur / Autrice : Simon Dusseaux
• Direction : Isabelle Maynial
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Ingénierie Microbienne et Enzymatique
• Date : Soutenance le 21/07/2014
• Etablissement(s) : Toulouse, INSA
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences écologiques, vétérinaires, agronomiques et bioingénieries (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire d'ingénierie des systèmes biologiques et des procédés (Toulouse) - Laboratoire d'Ingéniérie des Systèmes Biologiques et des Procédés (LISBP) - INSA Toulouse - Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés [LISBP]
• Jury : Président / Présidente : Nicholas Lindley
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Maynial, Henri-Pierre Fierobe, Philippe Soucaille
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mickael Desvaux, Chantal Tardif

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microorganismes -- Biotechnologie

Biocarburants

Isopropanol

Mots clés libres

Ingénierie métabolique

C. acetobutylicum

Isopropanol

Biocarburant

Metabolic engineering

C. acetobutylicum

Isopropanol

Biofuel

Résumé

Une stratégie d’ingénierie du métabolisme de C. acetobutylicum a été développée afin de construire une souche capable de produire de l’isopropanol à partir de sucres en C5, en C6 ou de substrats plus complexes. Dans un premier temps, une souche de C. acetobutylicum a été ingénieriée pour la production d’un mélange isopropanol/butanol/éthanol (IBE), ce microorganisme n’étant pas capable de produire naturellement de l’isopropanol. Différents opérons, exprimant une voie synthétique de production d’isopropanol, ont été construits et introduits à partir d’un plasmide dans une souche chez laquelle la voie de synthèse du butyrate a été supprimée (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk). La souche la plus performante a été sélectionnée à partir de cultures réalisées en fermenteur, en mode discontinu à pH 5,0 et s’est avérée être celle exprimant la voie de l’isopropanol sous la dépendance du promoteur thl. Une optimisation des paramètres de culture a conduit à la production d’un mélange IBE, à partir de glucose, à une concentration de 21 g.l-1, un rendement de 0,34 g.g-1 et une productivité de 0,8 g.l-1.h-1. La production du mélange IBE à partir de xylose ou de xylane comme unique source de carbone a également été démontrée et permet une production IBE de 10,4 g.l-1 avec un rendement de 0,31 g.g-1 sur xylose et une production IBE de 4,28 g.l-1 avec un rendement de 0,28 g.g-1 sur xylane. Enfin, l’analyse des flux passant par la voie de l’isopropanol a permis d’identifier l’étape limitant la production de ce composé. Cette dernière semble être liée à la concentration en acétate intracellulaire et aux propriétés catalytiques la CoA-transférase, qui possède une faible affinité pour l’acétate. Ainsi, une CoA-transférase synthétique basée sur les caractéristiques de la CoA-transférase AtoAD d’E. coli, qui est décrite comme ayant un Km pour l’acétate plus faible, a été conçue et exprimée dans la souche précédement construite afin de tenter de lever la limitation de la voie de synthèse de l’isopropanol. Dans un deuxième temps, des modifications supplémentaires du métabolisme de C. acetobutylicum ont été effectuée afin de produire de l’isopropanol comme unique produit de fermentation à partir de glucose ou de xylose. Différentes stratégies ont alors été évaluées dans le but de contourner le déséquilibre rédox causé par la délétion des voies parasites consommatrices de carbone. Ainsi, des outils permettant la mesure d’activité hydrogénase, in-vivo et in-vitro, ont été développés pour tester la fonctionnalité de 3 hydrogénases, utilisant la bifurcation d’électrons pour la production d’H2 à partir de NADH et de ferrédoxine. Une deuxième stratégie utilisant les potentialités de la voie des phosphocétolases pour la métabolisation du xylose en acétyl-CoA a été étudiée et des résultats prometteurs ont été obtenus malgré les limitations actuellement rencontrées

First, C. acetobutylicum was metabolically engineered to produce a biofuel consisting of an isopropanol/butanol/ethanol (IBE) mixture. Different synthetic isopropanol operons were constructed and introduced on plasmids in a butyrate minus mutant strain (C. acetobutylicum ATCC 824 Δcac15ΔuppΔbuk) in which the butyrate pathway was deleted. The best strain expressing the isopropanol operon from the thl promoter was selected from batch experiments at pH 5.0. By further optimizing the pH of the culture, an IBE mixture with almost no by-products was produced at a titer of 21 g.l-1, a yield of 0.34 g.g-1 and productivity of 0.8 g.l-1.h-1, values never reached before. IBE production was also shown to be efficient using xylose or xylan as the sole carbon source with 10.4 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.31 g.g-1 from xylose and 4.28 g.l-1 IBE produce at a yield of 0.28 g.g-1 from xylan. Furthermore, by performing in vivo and in vitro flux analysis of the synthetic isopropanol pathway, this flux was identified to be limited by acetate intracellular concentration and the high Km of CoA-transferase for acetate. A synthetic CoA-transferase based on the AtoAD E. coli characteristics was designed, synthesized and evaluated in vivo. This enzyme, that displays a lower Km for acetate, was found to be a good candidate to alleviate the bottleneck of the isopropanol pathway. Secondly, several strategies were evaluated to redraw C. acetobutylicum metabolism and finally construct a strain able to produce isopropanol as the only fermentation product from glucose or xylose. To overcome the severe redox imbalance caused by homo-isopropanolic fermentation, several strategies were investigated. On the one hand, a new class of electron bifurcating enzyme, the NADH hydrogenases, that can use NADH and ferredoxin to produce H2, were evaluated in C. acetobutylicum. This strategy opens the alternative to produce isopropanol and H2 from glucose without any carbon lost. On the other hand, the use of an alternative catabolic pathway, the phosphocetolase pathway, for xylose utilization and acetyl-CoA production was evaluated. These results allow the identification of the metabolic bottlenecks to overcome to obtain a C. acetobutylicum strain able to produce only isopropanol from xylose at high yield