Test de génotypage plaquettaire in vitro à base de sandwich de microparticules biofonctionnalisées : Détection par capteur de fluorescence à ondes évanescentes, imagerie de fluorescence et cytométrie en flux

Biofunctionnalized microparticles based sandwiches for in vitro platelet genotyping test : detection by evanescent waves biosensor, fluorescence scanner and flow cytometry

• Auteur / Autrice : Amandine Cornillon
• Direction : Jean-Pierre Cloarec, Eliane Souteyrand, Paul Charette
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : STIC santé et micro et nano-technologies
• Date : Soutenance le 18/12/2014
• Etablissement(s) : Ecully, Ecole centrale de Lyon en cotutelle avec Université de Sherbrooke (Québec, Canada)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Électronique, électrotechnique, automatique (Lyon)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement public : Etablissement français du sang
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des nanotechnologies de Lyon
• Jury : Président / Présidente : Marie-Hélène Delville
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean-Pierre Cloarec, Eliane Souteyrand, Paul Charette
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Denis Boudreau, Christine Ménager

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytométrie de flux

Ondes évanescentes

Génotype

Plaquettes sanguines

Mots clés libres

Microparticules magnétiques

Microparticules fluorescentes

Sandwichs

Génotypage plaquettaire

Capteur à ondes évanescentes

Cytométrie en flux

Oligonucléotide

Magnetic microparticles

Fluorescent microparticles

Sandwiches

Platelet genotyping

Evanescent wave sensor

Flow cytometry

Oligonucleotide

Résumé

Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur.

This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.