Sélection et caractérisation d’aptamères oligonucléotidiques régulateurs de la protéine STAT5B, impliquée dans les leucémies

Selection and characterization of DNA aptamers regulating STAT5B, a protein involved in leukemias

• Auteur / Autrice : Claire Loussouarn
• Direction : Bérangère Bihan-Avalle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biotechnologie : Unité de recherche Génie Enzymatique et Cellulaire - GEC (FRE-3580)
• Date : Soutenance le 20/03/2014
• Etablissement(s) : Compiègne
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences pour l'ingénieur (Compiègne)

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN

ADN

Ligands (biochimie)

Protéines

Mort cellulaire

Apoptose

Oligonucléotides

Cellules cancéreuses

Différenciation cellulaire

Prolifération cellulaire

Oncogènes

Aptamères

Facteurs de transcription

Facteur inhibant les cellules leucémiques

Thérapeutique

Leucémie

Mots clés libres

Méthode SELEX (évolution systématique de ligands par enrichissement exponentiel)

Facteurs de transcription STAT5

Leucogénèse

Protéines STAT5

Signalisation cellulaire

JAK/STAT

Leukemia

Leukemia inhibitory factor

Aptamers

Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment method (SELEX method)

Transcription factors

Oncogenes

Cell proliferation

Cell differentiation

Apoptosis

Cell death

STAT5 protein (Signal Transducers and Activators of Transcription)

DNA

RNA

Résumé

Les cancers, qu’il s’agisse de leucémies ou de tumeurs solides, sont le résultat de proliférations cellulaires anormales et non contrôlées au sein des tissus. Ces proliférations anarchiques sont le reflet d’une surexpression et/ou sur-activation de protéines intracellulaires engendrées par un événement oncogénique. Aujourd’hui encore il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules à usage thérapeutique ciblant spécifiquement ces protéines. C’est dans ce contexte que les facteurs de transcription STAT5 constituent de véritables cibles de choix puisque ces protéines participent activement à la leucogénèse. L’implication directe des protéines STAT5 dans la génèse des leucémies a été démontrée par l’utilisation de formes mutées constitutivement active de STAT5. Les facteurs de transcription STAT5 jouent un rôle essentiel dans la voie de signalisation JAK/STAT. Cette voie aboutit à la régulation de grandes fonctions biologiques telles que la prolifération cellulaire, la différenciation cellulaire ou encore l’apoptose. L’objectif de ce projet consiste donc à cibler spécifiquement les protéines STAT5 dans le but de rétablir le processus de mort cellulaire et empêcher la prolifération des cellules cancéreuses. Les inhibiteurs spécifiques des protéines STAT5 sont sélectionnés selon la méthode SELEX qui permet d’isoler des ligands structurés de forte affinité pour la protéine. L’affinité et la spécificité de ces inhibiteurs, appelés aptamères, sont caractérisées à partir de modèles cellulaires de leucémies dépendant de l’activité des facteurs de transcription STAT5. Les aptamères sont aujourd’hui de véritables outils thérapeutiques en pleine évolution.

Leukemias are due to abnormal cell proliferation, which is the result of intracellular over-expression or excessive activation of protein due to oncogenic event. Still today, it is necessary to find new therapeutic molecules, which specifically target these proteins. STAT5, via the JAK/STAT signaling pathway, controls fundamental cellular processes, including .cell survival, proliferation and differentiation. To struggle against tumorigenesis, JAK/STAT signaling pathway has to be inhibited. The aim of this project is to target specifically STAT5 factors to restore healthy signal transduction. We generated aptamers by an iterative in vitro selection. Aptamers are short-structured single strand DNAs or RNAs that bind with high affinity and specificity to their target. Once STAT5B recombinant proteins are produced, they are subjected to SELEX process. The number of rounds depends on various parameters. After seven rounds, two sequences are retrieved. The specificity and affinity of these aptamers are assessed by fluorescent immunoassays. Binding affinity and kinetics of interaction are characterized by SPR. Aptamer anti proliferative effects are determined by evaluation of the growth of cells depending on STAT5. Finally, we developed several .assays aiming at understanding the mechanism of an aptamer action on STAT5B such as phosphorylation measurement and EMSA. Aptamers are now emerging therapeutic tools; they exhibit significant advantages relative to protein therapeutics.