Thèse soutenue

Etude de la transcétolase de Geobacillus stearothermophilus et modification de son énantiosélectivité par ingénierie enzymatique

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Auteur / Autrice : Juliane Abdoul-Zabar
Direction : Laurence Hecquet
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie Organique Biologique
Date : Soutenance le 10/01/2014
Etablissement(s) : Clermont-Ferrand 2
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences fondamentales (Clermont-Ferrand)
Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Institut de Chimie de Clermont-Ferrand (Aubière, Puy-de-Dôme ; 2012-....)
Laboratoire : (ICCF) Institut de Chimie de Clermont-Ferrand
Jury : Président / Présidente : Marius Réglier
Examinateurs / Examinatrices : Magali Remaud, Virgil Helaine, Bastien Doumèche, Wolf-Dieter Fessner
Rapporteurs / Rapporteuses : Magali Remaud

Résumé

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La transcétolase (TK, EC 2.2.1.1) est une enzyme catalysant la formation de cétoses de configuration D-thréo à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2R), par formation stéréospécifique d’une liaison C-C. L’objectif de ces travaux est d’inverser l’énantiosélectivité de cette enzyme par ingénierie afin d’obtenir des cétoses L-érytho (recherchés pour leurs applications potentielles dans les domaines pharmaceutique et/ou nutritionnel) à partir d’aldéhydes α-hydroxylés (2S). Dans ce but, une TK thermostable (mTKgst) issue de la bactérie thermophile Geobacillus stearothermophillus a d’abord été identifiée et produite. L’étude de sa structure tridimensionnelle a permis d’identifier deux résidus du site actif ayant un rôle potentiel dans l’inversion de son énantiosélectivité : Leu382 et Asp470. Des banques demTKgst mutées ont alors été créées, selon deux stratégies : rationnelle et semi-rationnelle. La première a consisté à muter les deux résidus sélectionnés par mutagenèse par saturation de site, tandis que la seconde a consisté à modifier deux séquences de cinq résidus contigus à aux positions clés, selon la mutagenèse par cassette. Afin d’identifier les mTKgst mutées d’intérêt, un test de criblage à haut-débit a été mis au point, basé sur le suivi pH-métrique de la réaction en présence de rouge de phénol. A l’issue du criblage, le variant mTKgst-L382D/D470S a été mis en évidence. Son activité vis-à-vis d’un aldéhyde modèle de configuration (2S) a été augmentée d’un facteur 5 par rapport à l’enzyme sauvage et la perte de l’énantiosélectivité vis-à-vis desaldéhydes (2R) a été confirmée.