Étude fonctionnelle de l'orthologue cristalline αB dans le développement musculaire et la stabilisation du sarcomère chez Drosophila melanogaster

Functional analysis of αB-crystallin's orthologue in muscle development and sarcomere stabilisation in Drosophila melanogaster

• Auteur / Autrice : Inga Wojtowicz
• Direction : Krzysztof Jagla, Małgorzata Daczewska
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la sante
• Date : Soutenance le 15/12/2014
• Etablissement(s) : Clermont-Ferrand 1 en cotutelle avec Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego (Wrocław)
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences de la vie, santé, agronomie, environnement (Clermont-Ferrand)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Génétique, Reproduction et Développement (Clermont-Ferrand) - (GRED) Génétique- reproduction et développement
• Jury : Président / Présidente : Grazyna Klobus
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Krzysztof Jagla, Małgorzata Daczewska, Elzbieta Pyza, Jolanta Redowicz, Bozena Simiczyjew, Gabriel Bugla-Ploskonska, Zuzanna Drulis-Kawa

Mots clés

Mots clés contrôlés

Drosophila melanogaster

génétique

Chaîne B de la cristalline alpha

Mots clés libres

Drosophila

Chaîne B de la cristalline alpha

Desminopathie

Drosophila

Alpha-Crystallin B Chain

Desminopathy

Résumé

Le gène CG4533 (l (2) efl, dcryAB) de la drosophile est un orthologue de la cristalline αB des vertébrés, qui code une petite protéine de choc thermique (sHsp). L'activité la plus importante des sHsps est de lier des protéines et de les protéger contre l'agrégation, empêchant l'accumulation de protéines partiellement dénaturées dans les cellules musculaires. La cristalline αB est également impliquée dans la phase initiale de différenciation du muscle squelettique. Il a été démontré que la cristalline αB joue un rôle clé dans la différenciation musculaire, et sa forme mutée est impliquée dans des desminopathies humaines. Mes résultats ont révélé que le gène dcryAB est spécifiquement exprimé dans les muscles des parois larvaires et que le profil d 'expression de dCryAB rappelle la localisation de l' orthologue αB-cristallin humain. En utilisant les anticorps polyclonaux générés, on a trouvé que la protéine dCryAB était abondamment exprimée dans tous les muscles de la paroi des larves, qu'elle s'accumulait dans une zone périnucléaire et présentait un profil strié au niveau des lignées M et Z. Pour évaluer le rôle de dcryAB dans le développement musculaire, l'atténuation des gènes spécifiques au muscle médiée par l'ARNi a été pratiquée. Le knockdown dcryAB conduit à des défauts importants dans la morphologie musculaire. La majorité des larves observées présentaient des défauts d'organisation des sarcomères, caractérisés par un motif irrégulier et flou des lignes Z dans les grands segments musculaires et un plus petit nombre de noyaux musculaires. Ce schéma sarcomérique aberrant était souvent associé à une scission musculaire entraînant une altération de l'attachement musculaire ou à la perte du muscle affecté. Les analyses ultrastructurales ont confirmé l'organisation altérée des sarcomères, révélant également des mitochondries à crêtes mitochondriales à peine visibles et une quantité accrue de glycogène entre les myofilaments. De plus, l'atténuation du dcryAB spécifiquement dans le mésoderme a conduit à une altération de la fonctionnalité des muscles larvaires et a affecté la durée de vie de la drosophile, ce qui implique le rôle du dcryAB dans le développement musculaire. Les études présentées ont également révélé que, dans les muscles larvaires de la drosophile, l'anticorps anti-vimentine de souris détectait une protéine co-localisée avec dCryAB dans la lignée Z et était présente dans la zone nucléaire. Je crois que Drosophila exprime des protéines qui correspondent à la troisième classe de filaments intermédiaires de vertébrés, qui partagent une distribution intracellulaire similaire avec leurs homologues vertébrés. Des approches co-IP ont confirmé que dCryAB interagit avec la protéine de type vimentine comme l'αB-cristalline interagit avec la desmine. Ainsi, il est attendu que la protéine de type vimentine puisse avoir des propriétés des protéines de filaments intermédiaires de troisième classe, renfermant de la vimentine et de la desmine. Des analyses effectuées suggèrent que dCryAB assure l'intégrité structurale des muscles somatiques en interagissant avec les protéines IF potentielles. Chez l'homme, la substitution de R120G dans l'αB-cristalline conduit à la perte de son activité chaperon IF et induit des agrégations de desmine dans les muscles, provoquant une myopathie liée à la desmine (DRM). L'avantage de la conservation de l'αB-cristalline a été pris pour tester si dCryAB muté Drosophila affiche des propriétés similaires à celle de son homologue vertébré. J'ai trouvé que l'expression musculaire spécifique de dCryABR120G muté a provoqué la formation d'agrégats intracellulaires contenant la protéine de type vimentine ainsi que dCryABR120G. Ces symptômes ont conduit à une faiblesse musculaire caractéristique des patients avec DRM. Mes études ont révélé que le dCryABR120G imite les effets de la mutation dans l'αB-cristalline humaine, donc Drosophila peut représenter un système modèle approprié pour étudier la DRM.

The Drosophila CG4533 (l(2)efl, dcryAB) gene is an orthologue of vertebrate αB-crystallin, which encodes a small heat shock protein (sHsp). The most prominent activity of sHsps is binding proteins and protecting them from aggregation, preventing the accumulation of partially denatured or improperly folded proteins in muscle cells. αB-­crystallin is also implicated in the initial phase of skeletal muscle differentiation. It was demonstrated that αB-­crystallin plays a key role in muscle differentiation and its mutated form is involved in human desminopathies. My results revealed that dcryAB gene is specifically expressed in larval body wall muscles and the dCryAB expression pattern was reminiscent of the localisation of its human orthologue αB-­crystallin. Using the generated polyclonal antibodies it was found that dCryAB protein was abundantly expressed in all larval body wall muscles, it was accumulated in a perinuclear area and displayed a striated pattern at the level of M-­ and Z-­lines. To assess the dcryAB role in muscle development RNAi-­mediated muscle-­specific gene attenuation was applied. The dcryAB knockdown led to formation of muscles characterised by significant defects in muscle morphology. The majority of the observed larvae exhibited defects in sarcomeric organisation, characterised by an irregular, fuzzy pattern of Z-­lines in large muscle segments and smaller number of muscle nuclei. This aberrant sarcomeric pattern was often associated with muscle splitting leading to an altered muscle attachment or to the loss of the affected muscle. Ultrastuctural analyses confirmed altered sarcomeres organisation, revealing also mitochondria with barely visible mitochondrial crests and increased amount of glycogen between myofilaments. Moreover, dcryAB attenuation specifically in mesoderm led to impaired functionality of larval muscles and affected Drosophila life span, implicating dcryAB role in muscle development. Presented studies also revealed that in Drosophila larval muscles mouse anti-­vimentin antibody detected a protein which co-­localised with dCryAB in the Z-­line and was present in the nuclear area. I believe that Drosophila expresses proteins that correspond to the third class of vertebrate intermediate filaments, which share a similar intracellular distribution with their vertebrate counterparts. Using co-­IP approaches it was confirmed that dCryAB interacts with the vimentin-­like protein like αB-­crystallin interacts with desmin. Thus it is expected that the vimentin-­like protein may have properties of the third class intermediate filament proteins, enclosing vimentin and desmin. Performed analyses suggest that dCryAB ensures structural integrity of somatic muscles by interacting with potential IF proteins. In human, R120G substitution in αB-­crystallin leads to the loss of its IF chaperone activity and induces aggregations of desmin in muscles, causing desmin-­related myopathy (DRM). The advantage of the αB-­crystallin conservation has been taken to test whether Drosophila mutated dCryAB displays similar properties as its vertebrate counterpart. I found that muscle-­specific expression of mutated dCryABR120G caused formation of intracellular aggregates containing the vimentin-­like protein as well as dCryABR120G. These symptoms led in consequence to muscle weakness, which is characteristic for patients with DRM. My studies revealed that mutated dCryABR120G mimics effects of mutation in human αB-­crystallin, therefore Drosophila may represent a suitable model system to study DRM.