Le rôle de la protéine adénovirale de capside VI dans la modulation du cycle cellulaire

The role of adenoviral capsid protein VI in cell cycle modulation

• Auteur / Autrice : Remi Vaillant
• Direction : Harald Wodrich, Thomas Dobner
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie-Immunologie
• Date : Soutenance le 08/12/2014
• Etablissement(s) : Bordeaux en cotutelle avec Universität Hamburg
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement d'accueil : Université Bordeaux-II (1971-2013)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Microbiologie fondamentale et pathogénicité (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Jean Rosenbaum
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Richard Iggo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Jariel-Encontre, Thomas Sternsdorf

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cycle cellulaire

Gène p53

Adénoviridés

Mots clés libres

Adenovirus

Protein VI

P53

Cycle cellulaire

Adenovirus

Protein VI

P53

Cell cycle

Résumé

Les Adénovirus humains sont des virus non enveloppés se répliquant dans le noyau des cellules hôtes.Durant l’infection et après leur entrée par endocytose, les Adénovirus sont transportés au noyau pourinitier l’expression du génome viral. Dans l’endosome, les capsides virales subissent un désassemblagepartiel et libèrent le facteur viral lytique, la protéine VI (pVI). Au niveau de la membrane de l’endosome,cette protéine va alors induire sa rupture permettant ainsi le relargage des virions au sein du cytoplasmegrâce à son hélice amphipatique N-terminale. Par la suite, pVI est transportée vers des structuresnucléaires appelées PML nuclear bodies (PML-NB), associée une ubiquitine ligase cytoplasmique, laNedd4.2. Les PML-NB sont des complexes nucléaires multi-protéiques qui ont des propriétésantivirales. Celles-ci impliquent le recrutement de facteurs de transcription répressifs comme parexemple la protéine anti apoptotique Daxx ou encore le suppresseur de tumeur p53, impliqué dans larégulation du cycle cellulaire. Il a été montré que la protéine pVI en complexe avec Nedd4.2 induit larelocalisation de Daxx des PML-NB dans le cytoplasme, ce qui permet une expression efficace dugénome viral. Ainsi, l’inhibition fonctionnelle de Daxx par pVI suggère que cette protéine virale puisseaussi être impliquée dans la restriction de p53.Dans cette étude, nous avons montré que le nombre des modifications post-traductionnelles (PTM) dep53 augmentent en présence de pVI dans la cellule. De plus, les données obtenues montrent quel’expression de pVI affecte la transcription dépendante de p53 et que l’interaction avec Nedd4.2 n’estpas nécessaire pour inhiber les fonctions de p53. Pour étudier l’implication de pVI dans la modulationdu cycle cellulaire, nous avons créé une lignée cellulaire humaine exprimant cette protéine virale defaçon stable. La caractérisation de cette lignée a permis de mettre en évidence une prolifération cellulaireaccrue. Nos observations ont aussi montré une perte importante des PML-NB et une réduction desprotéines clés du cycle cellulaire p53 et pRb, un autre suppresseur de tumeur. Par des techniques demicro-injection et l’utilisation de l’inhibiteur MG132, nous avons observé que ces deux facteurscellulaires sont ciblés vers le protéasome et dégradés lors de la surexpression de pVI. L’étude desfonctions de cette protéine virale laisse penser que la protéine pVI présente un potentiel oncogéniquecar en effet, sa surexpression induit la dérégulation de l’homéostasie cellulaire et l’inhibition desuppresseurs de tumeur, comme p53 et pRb.

Humane Adenoviren (HAdV) sind unbehüllte Doppelstrang-DNA-Viren mit einem Proteinkapsid, diesich im Wirtzellkern replizieren. Der lytische Infektionsverlauf beginnt mit dem rezeptor-vermitteltenEintritt des Viruspartikels und dem gerichteten Transport des viralen Genoms zum Wirszellkern. Dasvirale Protein VI (pVI) ist nötig um den effizienten Austritt des bereits disassemblierten Viruspartikelsaus dem zellulären Endosom zu gewährleisten. Durch eine amphipathische Helix im N-terminalenProteinbereich interkaliert dieser lytische Faktor in die endosomale Membran und führt zum Aufbruchdes zellulären Organells. pVI wird anschließend an zelluläre Kernstrukturen, sogenannte PML nuclearbodies (PML-NBs) lokalisiert und komplexiert dort mit der zytoplasmatischen Ubiquitinligase Nedd4.2.PML-NBs stellen nukleäre Multiproteinkomplexe dar, die mittlerweile aufgrund ihrer antiviralenEigenschaften in den Mittelpunkt der virologischen Forschung gerückt sind. Diese zellulären Aggregatebestehen hauptsächlich aus repressiven Transkriptionsfaktoren, wie dem anti-apoptotischen DaxxProtein sowie dem Tumosupressor p53. In diesem Zusammenhang konnte bereits eine pVI-vermittelteRelokalisation des Daxx Proteins aus den PML-NBs gezeigt und als Vorraussetzung zur effizientenVirusgenexpression bestätigt werden. Es stellte sich im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Frage, obneben der pVI-abhängigen Daxx Inhibition, auch p53 ein Zielprotein des viralen Capsidproteinsdarstellt.Unsere Arbeiten zeigen erstmals, dass nach der pVI Expression vermehrt posttranslationaleModifikationen am p53 Protein beobachtet werden. Weitere Befunde konnten außerdem einen Einflussvon pVI auf die p53-abhängige Transaktivierung zellulärer Promotoren beweisen. Mittelsbiochemischer Analysemethoden konnten wir zeigen, dass die Kooperation zwischen pVI und Nedd4.2keine Rolle bei der p53 Inhibition zu spielen scheint. Um im nächsten Schritt die Rolle von pVI imZellzyklus genau zu beleuchten, wurde zunächst ein zell-basiertes Modelsystem mit stabilerÜberexpression des viralen Faktors generiert, Anschließende phenotypische Analysen konnten zeigen,dass die Anwesenheit von pVI zur Steigerung der Zellproliferationsrate führt. Im Rahmen unsererUntersuchungen konnten wir auch einen signifikanten Verlust zellulärer PML-NBs beobachten sowieeine Reduktion der p53 und pRb Proteinkonzentration nachweisen. Mittels unter Verwendung vonMikroinjektion und dem Inhibitor MG132 war es uns möglich zu zeigen, dass pVI den proteasomalenProteinabbau der beiden Wirtszelldeterminaten p53 und pRb induziert. Deswegen kann man basierendauf den erhobenen Befunden zur pVI vermittelten Dysregulierung des zellulären Wachstums einonkogenens Potenzial des viralen Faktors annehmen.

Human Adenovirus are non-enveloped viruses which replicate inside the host cell nucleus. Uponinfection and after receptor-mediated entry, they are transported towards the nucleus to initiate the viralgene expression. Viral capsids deliver from the endosome into the cytoplasm by partial disassembly andrelease inside the endosome mediated by viral lytic factor protein VI (pVI). pVI is targeted to themembrane via an amphipathic helix structure in the N-terminus of the viral protein. After membranerupture and capsid release, pVI is transported to sub-nuclear structures, so-called PML nuclear bodies(PML-NBs), together with the cytoplasmic ubiquitin ligase Nedd4.2. PML-NBs represent multiproteinaggregates in the host-cell nucleus with an antiviral capacity, as to several PML-associated repressivetranscription factors, such as the anti-apoptotic Daxx protein and the tumor suppressor p53 were reportedto localize at these foci. In addition, pVI-mediated displacement of Daxx from PML-NBs was shown tooccur in dependency of Nedd4.2 to support efficient viral gene expression. Therefore, we postulate thatbesides Daxx functional inhibition, pVI might also be involved in p53 restriction.Here, we show that p53 posttranslational modification (PTM) is increased when pVI protein is presentin the host-cell. Moreover, we obtained data that pVI expression severely impacts p53 inducedtransactivation of cellular transcription. Biochemical approaches indicate that pVI binding of theubiquitin ligase Nedd4.2 is no prerequisite for the capacity to inhibit p53 functions. In a next step toelucidate the role of pVI on cell cycle regulation, we generated a human cell line stably expressing theviral pVI protein. Our characterization analyses show significantly that these cells benefit from thepresence of pVI as we proved increased cell proliferation rates. We also observed an intense loss ofPML-NBs and reduced protein concentrations of cycle key regulators p53 and pRb. Usingmicroinjection and the inhibitor MG132 we were able to show that both cellular restriction factors weresequestered into the proteasomal degradation pathway of the cell. Evaluation of pVI functions temptedus to speculate, whether pVI might execute oncogenic potential upon overexpression, due toderegulation of host-cell homeostasis and inhibition of tumor suppressive determinants.