Structural and functional study of the polyketide synthase PpsC and its activator PptT from mycobacterium tuberculosis

• Auteur / Autrice : Alexandre Faille
• Direction : Jean-Denis Pedelacq, Lionel Mourey
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et fonctionnelle
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Toulouse 3

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mycobacterium tuberculosis

Acétogénines

Mots clés libres

Polykétide

Polykétide synthase

Tuberculose

Deshydratase

Ppsc

Dimycocérosates de phthiocérol

Cristallographie

Domain trapping

Résumé

PpsC est une polykétide synthase mono-modulaire de type I essentielle à la synthèse de facteurs de virulence chez Mycobacterium tuberculosis appelés dimycocérosates de phthiocérol. Afin d'aider à la découverte de nouveaux anti-tuberculeux et de mieux comprendre le mécanisme employé par les polykétide synthases, nous avons entrepris l'étude structurale et fonctionnelle de PpsC par cristallographie des rayons X. Les polykétide synthases de type I sont composées de plusieurs domaines, chacun possédant une activité catalytique différente. Nous avons utilisé la méthode du domain trapping pour identifier des fragments solubles représentant chaque domaine de PpsC. L'étude de ces fragments a permis de déterminer la structure des domaines acyl-transférase, déshydratase, et enoyl-reductase de PpsC. Nous avons aussi caractérisé le mécanisme catalytique du domaine déshydratase en se basant sur la structure d'un complexe enzyme-substrat et de tests enzymatiques in vitro. Les polykétide synthases doivent être activées par le transfert d'un groupe prosthétique sur leur domaine porteur d'acyl. Chez Mycobacterium tuberculosis, PptT est responsable de l'activation et est donc essentielle à la virulence. En utilisant la technologie split-GFP, nous avons mis au point un protocole de production et purification de PptT où des cofacteurs jouent un rôle essentiel à sa stabilité in vivo et in vitro. L'activité de l'enzyme a été caractérisée par le transfert in vitro du groupe prosthétique sur le domaine porteur d'acyl de PpsC. Enfin, nous avons résolu la structure tridimensionnelle de PptT à 1,4 A par cristallographie aux rayons X, permettant ainsi la conception rationnelle d'inhibiteurs.

PpsC is a type-I mono-modular polyketide synthase essential for the synthesis of phthiocerol dimycocerosates virulence factors in Mycobacterium tuberculosis. In an attempt to both help the search for new antituberculosis drugs, and decipher the complex mechanism used by polyketide synthases, we have undertaken the functional and structural study of PpsC using X-ray crystallography. Type-I polyketide synthases are made of several domains, each possessing a different catalytic activity. We have used the recently developed domain trapping method to identify soluble fragments representing each domain of PpsC. The study of these fragments has led to the structural determination of the acyltransferase, dehydratase, and enoylreductase domains of PpsC. In addition, we have deciphered the catalytic mechanism of the dehydratase domain, based on the structure of a substrate-enzyme complex and in vitro enzymatic tests. Polyketide synthases need to be activated by the transfer of a prosthetic group onto their acyl carrier protein domain. In Mycobacterium tuberculosis, PptT is responsible for the activation of polyketide synthases and is thus essential to its virulence. Using the split-GFP technology, we have designed a protocol for the production and purification of PptT, where its co-factors play an essential role for its stability both in vivo and in vitro. Activity of the enzyme was assessed by in vitro transfer of the prosthetic group onto the acyl carrier protein domain of PpsC. Finally, we have solved the structure of PptT at 1. 4 A resolution using X-ray crystallography, which will allow the structure-based design of inhibitors.