Interaction champ électrique cellule : conception de puces microfluidiques pour l’appariement cellulaire et la fusion par champ électrique pulsé

Electric field-cell interaction : conception of microfluidic biochips for cell pairing and fusion by electric field pulses

• Auteur / Autrice : Feriel Hamdi
• Direction : Elisabeth Dufour-Gergam, Bruno Le Pioufle
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 29/11/2013
• Etablissement(s) : Paris 11
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences et Technologies de l'Information, des Télécommunications et des Systèmes (Orsay, Essonne ; 2000-2015)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Systèmes et applications des technologies de l'information et de l'énergie (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2002-....)
• Jury : Président / Présidente : Lluis Maria Mir
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bruno Le Pioufle, Lluis Maria Mir, Gaëlle Lissorgues, Liviu Nicu, Marie Frenea-Robin, Frédéric Subra, Olivier Français
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Gaëlle Lissorgues, Liviu Nicu

Mots clés

Mots clés contrôlés

Laboratoires sur puces

Diélectrophorèse

Microfluidique

Électrofusion

Mots clés libres

Électrofusion

Laboratoire sur puce

Microfluidique

Diélectrophorèse

Electrofusion

Lab-On-Chip

Microfluidics

Dielectrophoresis

Résumé

La fusion cellulaire est une méthode de génération de cellules hybrides combinant les propriétés spécifiques des cellules mères. Initialement développée pour la production d’anticorps, elle est maintenant aussi investiguée pour l’immunothérapie du cancer. L’électrofusion consiste à produire ces hybrides en utilisant un champ électrique pulsé. Cette technique présente de meilleurs rendements que les fusions chimiques ou virales, sans introduire de contaminant. L’électrofusion est actuellement investiguée en cuve d’électroporation où le champ électrique n’est pas contrôlable avec précision et le placement cellulaire impossible, produisant de faibles rendements binucléaires. Afin d’augmenter le rendement et la qualité de fusion, la capture et l’appariement des cellules s’avèrent alors nécessaires.Notre objectif a été de développer et de réaliser des biopuces intégrant des microélectrodes et des canaux microfluidiques afin de positionner et d’apparier les cellules avant leur électrofusion. Une première structure de piégeage se basant sur des plots isolants et l’utilisation de la diélectrophorèse a été réalisée. Afin d’effectuer des expérimentations sous flux, une méthode de scellement des canaux, biocompatible et étanche a été développée. Puis, le milieu d’expérimentation a été adapté pour l’électrofusion. En confrontant les résultats des expériences biologiques aux simulations numériques, nous avons pu démontrer que l’application d’impulsions électriques induisait la diminution de la conductivité cytoplasmique. Nous avons ensuite validé la structure par l’électrofusion de cellules. Un rendement de 55% avec une durée de fusion membranaire de 6 s a été obtenu. Dans un second temps, nous avons proposé deux microstructures de piégeage pour l’électrofusion haute densité. La première se base sur un piégeage fluidique, alors que la seconde, utilise ladiélectrophorèse sans adressage électrique à l’aide de plots conducteurs. Jusqu’à 75% des cellules fusionnent dans cette dernière structure. Plus de 97% des hybridomes produits sont binucléaires. Le piégeage étant réversible, les hybridomes peuvent ensuite être collectés pour des études ultérieures.

Cell fusion is a method to generate a hybrid cell combing the specific properties of its progenitor cells. Initially developed for antibody production, it is now also investigated for cancer immunotherapy. Electrofusion consists on the production of hybridoma using electric pulses. Compared to viral or chemical methods, electrofusion shows higher yields and this system is contaminant free. Actually, electrofusion is investigated in electroporation cuvettes, where the electric field is not precisely controllable and cell placement impossible, resulting in low binuclear hibridoma yields. To improve the fusion quality and yield, cell capture and pairing are necessary.Our objective was the development and realization of biochips involving microelectrodes and microfluidic channels to place and pair cells prior to electrofusion. A first trapping structure based on insulators and the use of dielectrophoresis has been achieved. In order to perform fluidic experiments, a biocompatible irreversible packaging was developed. Then, the experimental medium was optimized for electrofusion. Confronting the biological experiments and the numerical simulations, we showed that the application of electric pulses leads to a decrease of the cytoplasmic conductivity. The microstructure was validated by cell electrofusion. A yield of 55%, with a membrane fusion duration of 6 s has been achieved. Secondly, we proposed two trapping microstructures for high density electrofusions. The first one is based on a fluidic trapping while the second one uses dielectrophoresis, free of electric wiring, thanks to conductive pads. Up to 75% of paired cells were successfully electrofused with the conductive pads. More than 97% of the hybridoma were binuclear. The trapping being reversible, the hybridoma can be collected for further analysis.