Evaluation des performances analytiques de la PCR électrochimique en temps réel et analyse de biomolécules via la réalisation de courbes de fusion électrochimiques

• Auteur / Autrice : Mélanie Moreau
• Direction : Benoît Limoges, Damien Marchal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Électrochimie moléculaire et biologique
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Techniques électrochimiques

Oxydoréduction

Biomolécules

Sondes d'ADN

Techniques d'amplification d'acides nucléiques

Réaction de polymérisation en chaine en temps réel

Résumé

Détecter, quantifier, et analyser l'ADN d'une cible biologique est un enjeu majeur dans de nombreux domaines des sciences du vivant. Pour réaliser ces tests, les instruments de PCR en temps réel qui couplent amplification génique in vitro et détection par fluorescence, offrent simplicité d'utilisation (une seule étape), rapidité d'exécution (de quelques minutes à quelques heures), sensibilité de détection et spécificité (détection d'une cible biologique noyée dans un milieu biologique complexe). Ces derniers, de part la nature optique du système de détection, souffrent en revanche d'un coût d'acquisition et de maintenance élevé, sont fragiles et imposants et de ce fait difficilement miniaturisables. Pour pallier à ces contraintes, l'équipe du LEM a développé un mode de détection alternatif basé sur une mesure électrochimique, où le détecteur composé d'électrodes sérigraphiées est directement intégré au consommable et les sondes, interagissant préférentiellement avec l'ADN double brin, sont des complexes organométalliques ou des dérivées phénoliques. Suite au développement d'un démonstrateur préindustriel en collaboration avec la startup Easy Life Science, l'objectif de ce travail de thèse a été d'évaluer et d'améliorer les performances analytiques de l'approche puis de valoriser l'instrument via l'ouverture de nouveaux champs applicatifs d'analyse de biomolécules notamment à travers la réalisation de courbes de fusion électrochimiques. Au cours de ces travaux, il a été montré que les performances analytiques de la PCR électrochimique en temps réel (limite de détection de l'ordre du sub-attomolaire en ADN, sensibilité de l'ordre de quelques nanomolaires en ADN, large gamme de concentrations mesurables et reproductibilité) concurrençaient désormais celles offertes par les approches optiques commercialisées. De plus, la réalisation de courbes de fusion électrochimiques de biomolécules a permis l'analyse fine de divers variants génétiques (substitution nucléotidique de type SNP et mise en évidence de l'hétérozygotie) et le suivi du changement conformationnel de protéines pour l'évaluation de leur thermostabilité (en fonction de la composition du milieu et de la présence de ligands). In fine, l'objectif sera de proposer un dispositif instrumental aux multiples applications électroanalytiques, robuste, à bas coût, transportable et offrant des performances analytiques compétitives du marché actuel.

The detection, quantification and analysis of the DNA from various biological targets is of major interest in life sciences. To do so, the use of real-time PCR instruments allows to simultaneously conduct both the in vitro DNA amplification and the detection by fluorescence measurement. This technique offers easy operation (one step only), rapidity (from a few minutes to a few hours), high sensitivity and specificity (detection of a target in highly complex biological matrixes). Despite its efficiency, the technique still suffers from several drawbacks such as its relatively high cost (purchase and maintenance), its fragile optic setup and its poor ability to be miniaturized. The LEM laboratory has developed an alternative technique based on an electrochemical measurement where the detector, made out of screen-printed electrodes, is integrated to the consumable. The redox probes interact mainly with the double-stranded DNA molecule and are either organometallic complexes or phenolic derivatives. Following the development of a proof-of-concept instrument in collaboration with the company Easy Life Science, the main goal of the thesis was to evaluate and improve its analytical performances through the use' of different redox probes and take part in development of new electroanalytical methods for the analysis of biomolecules based on electrochemical melting curves. This work shows that the analytical performances of the electrochemical PCR compete now with its commercial fluorescence-based counterparts on several aspects: limit of detection (sub-attomolar of DNA), sensitivity (few nanomoles of DNA per liter), large calibration range (several orders of magnitude) and reproducibility. Notably, the obtained electrochemical melting curves allowed to differentiate many genetic variants (such as SNP and heterozygous sample) and to follow proteins conformational fluctuations to evaluate their thermal stability (depending on the biological matrix and/or the addition of ligands). To conclude, this work is a key stepping stone toward the commercialization of a robust and low¬cost electrochemical instrument offering a wide range of applications and able to compete on the PCR devices market.