Pseudopilus assembly, function and dynamics in the type II secretion System

• Auteur / Autrice : Mangayarkarasi Periasamy
• Direction : Olivera Francetic
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : [Biomolécules, biologie structurales, pathologies, biothérapies]
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Membrane cellulaire

Fimbriae bactériens

Modèles moléculaires

Systèmes bactériens de sécrétion

Résumé

Le système de sécrétion de type II (SST2) est une machinerie complexe permettant le transport spécifique de protéines repliées du périplasme vers la surface des bactéries à Gram-négatif. SST2 est très proche des systèmes d'assemblage des pili de type IV (PT4), qui sont des filaments fins et flexibles impliqués dans l'adhérence et la motilité des bactéries. La surproduction des composants du SST2 Pul de Klebsiella oxytoca, spécifique de la sécrétion de la pullulanase (PulA), conduit à l'assemblage de pili à la surface des bactéries cultivées sur milieu gélose. Ces pili sont composés essentiellement d'un polymère hélicoïdal de la pseudopiline majeure PulG. Selon le modèle actuel, le filament périplasmique de PulG appelé pseudopilus, agirait comme un piston pour permettre la sécrétion du substrat. Bien que l'assemblage du pseudopilus soit indispensable à la sécrétion, le lien mécanistique entre ces deux activités de SST2 est largement inconnu. A la base de la structure des pili PulG,déterminée au laboratoire, nous avons étudié plus en détail le fonctionnement et la dynamique de ce filament. Par des approches de microscopie électronique, de modélisation moléculaire et par des analyses biochimiques et fonctionnelles, nous avons montré que l'assemblage du pseudopilus et sa stabilité dépendent d'interactions distinctes. Par des approches in vivo et in vitro, nous avons identifié deux composants du SST2, PulF et PuIM qui, par interaction directe avec PulG dans la membrane, favorisent son assemblage en pili. Les résidus de PulG impliqués dans ces interactions sont indispensables à l'assemblage et à la fonction du système de sécrétion. Nous avons caractérisé ainsi les étapes précoces de l'assemblage du pseudopilus et identifié les étapes clés dans la fonction de SST2. Ces données nous ont permis de proposer un nouveau modèle d'assemblage impliquant la rotation du filament, qui pourrait s'appliquer aux autres filaments de cette superfamille.

The type II secretion system (T2SS) is a complex machinery that facilitates specific transport of folded proteins from the periplasm to the surface of Gram-negative bacteria. T2SSs are closely related to type IV pilus assembly systems (T4PS) that polymerize long thin fibers on bacterial surface involved in adhesion and motility. The Pul T2SS of Klebsiella oxytoca, dedicated to secretion of pullulanase (PulA), is one of the best-characterized models to study the mechanism of this process. When the 15 Pul system components are overproduced, the plate-grown bacteria also assemble pili on their surface, composed of the major pseudopilin, PulG. Under physiological conditions it is postulated that a periplasmic fiber, termed the pseudopilus, promotes PulA secretion. Assembly of the pseudopilus is essential for secretion. However, the mechanistic link between these two activities is largely unknown. It is currently hypothesized that pseudopilus acts in a piston-like mode to push the substrate through the large gated pore in the outer membrane. To test this model, our laboratory has determined the three-dimensional structure of the PulG pilus. This model has served as a framework to further analyze the function and dynamics of this fiber by an integrated approach. Combining EM analysis of purified PuIG fibers, flexible PulG pilus modeling and biochemical functional studies we have shown that distinct inter-protomer interfaces determine PulG pilus stability and protein secretion function. The power of this combinatorial approach has allowed us to demonstrate the rotational dynamics involved in the fiber assembly process. Further, for the first time, biochemical, mass spectrometric analysis and bacterial two-hybrid assays, have allowed capturing interactions between pseudopilins and the assembly platform members PulM and PulF. These studies have also delineated the region in the pseudopilins involved in the respective interactions. Together these results have paved way to postulate the early events in the inner membrane promoting PuIG fiber assembly. These findings have general implications for all fiber assembling nanomachines of this sort.