Analyses structurales et fonctionnelles comparées de la protéine non structurale NS2 des hepacivirus : topologie transmembranaire, activité protéolytique et rôle dans la morphogenèse des particules virales

Structural and functional analyses of the hepacivirus nonstructural 2 protein : membrane topology, proteolytic activity and role in virion morphogenesis

• Auteur / Autrice : Célia Boukadida
• Direction : Annette Martin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie procaryote et eucaryote
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 7

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéines virales non structurales

Virus GB-B

Protease La

Hepacivirus

Hépatite C

Résumé

Environ 150 millions de personnes sont infectées par le virus de l'hépatite C (VHC) et présentent un risque de développer à terme un carcinome hépatocellulaire. Ce travail a eu pour objectif d'étudier le rôle de la protéine non structurale 2 (NS2) du VHC et, plus particulièrement, de déterminer si les caractéristiques structurales et fonctionnelles de NS2 du VHC sont conservées pour deux virus phylogénétiquement proches, le virus GB-B (GBV-B) et l'hepacivirus non primate (NPHV) qui infectent respectivement des petits primates et des chevaux. Nos études structurales ont révélé que, malgré une identité de séquence limitée, les protéines NS2 du VHC et du GBV-B possédaient des organisations topologiques similaires, avec trois segments transmembranaires dans leur région N-terminale et un domaine cytosolique C-terminal. Nous avons démontré que NS2 du GBV-B et du NPHV étaient des protéases à cystéine permettant le clivage de la jonction NS2/NS3 et que NS2 du GBV-B était une protéase dimérique possédant une triade catalytique composite, comme NS2 du VHC. Cependant, contrairement au VHC et au NPHV, la région transmembranaire de NS2 du GBV-B est indispensable à son activité protéolytique. Nous avons montré que le rôle de NS2 dans l'assemblage des particules virales est virus- et génotype-spécifique. De plus, des interactions spécifiques entre les domaines N- et C-terminaux de NS2 du VHC semblent critiques pour la morphogenèse des virions. Nous avons également entrepris de développer une méthodologie d'imagerie permettant le suivi dynamique de NS2 du VHC dans des cellules vivantes infectées afin de mieux comprendre les mécanismes d'action de cette protéine dans le cycle des hepacivirus.

Hepatitis C virus (HCV) chronically infects approximately 150 million persons worldwide and is associated with cirrhosis and hepatocellular carcinoma. The objective of this work was to gain insight into the role of HCV nonstructural protein 2 (NS2) in the viral life cycle. With this aim, we undertook to determine whether structural and functional features of NS2 were conserved between HCV and two phylogenetically related viruses, GB virus B (GBV-B) and the non-primate hepacivirus (NPHV) that infect small primates and horses, respectively. Our membrane association and structural analyses revealed that despite limited sequence similarity, HCV and GBV-B NS2 proteins share a similar topological organization, with three transmembrane segments located in their N-terminal region and a cytosolic C-terminal domain. We further demohstrated that GBV-B and NPHV NS2 are cysteine auto-proteases responsible for the cleavage at the NS2/NS3 junction and that GBV-B NS2 is a dimeric protease containing a composite catalytic triad, as previously shown for HCV NS2. However, unlike for HCV and NPHV NS2, the transmembrane region of GBV-B NS2 is required for its proteolytic activity. Chimeric and trans-complementation approaches revealed that the role of HCV NS2 in particle assembly is virus and genotype specific. Moreover, our data suggested that functional interactions between the N- and C-terminal subdomains of HCV NS2 are critically involved in virion morphogenesis. Finally, we developed a fluorescent microscopy approach to follow HCV NS2 trafficking in live infected cells in order to gain further insight into the mechanisms of action of this protein during HCV life cycle.