Expression de 3 protéines membranaires, CYP3A4, MGST1 et P-gp, impliquées dans la détoxication cellulaire

Expression of three membrane proteins, CYP3A4 and P-gp MGST1, involved in cellular detoxification

• Auteur / Autrice : Sana Bakari
• Direction : Marcel Delaforge
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interdisciplinaire pour le vivant
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Détoxication

Glycoprotéine P

Protéines membranaires

Résumé

Les xénobiotiques présents dans l’environnement peuvent être toxiques pour les organismes, et leurs effets restent difficiles à évaluer, en particulier à cause de synergies possibles entre eux. La voie cellulaire qui aboutit à l’élimination de ces xénobiotiques est un processus de détoxication mettant en place 3 systèmes enzymatiques spécialisés et complémentaires, principalement au niveau du foie. Il s’agit des monooxygénases, principalement des cytochromes P450 (phase I), des enzymes de conjugaison, ou transférases (phase II), et des protéines d'efflux actif (phase III). Les gènes codant pour les 3 enzymes de détoxication, CYP3A4, MGST1, et P-gp, ont été exprimés dans L. Lactis selon 2 stratégies de clonage: clonage classique et clonage compatible avec Gateway. La technologie Gateway est l’un des systèmes les plus efficaces, qui a déjà permis une expression efficace de protéines membranaires de diverses origines dans L. Lactis. L’expression hétérologue de certaines protéines de notre étude (CYP3A4 et MGST1 de rat et humaine) s’est révélée efficace. En effet, avec des taux de 5% de protéines membranaires totales pour le CYP3A4, et entre 2 et 4% pour la MGST1, L. Lactis semble être un système d’expression adapté à ces 2 enzymes. Des études fonctionnelles préliminaires sur des fractions membranaires non solubilisées montrent cependant que seule la MGST1 de rat est active. La P-gp, quant à elle, n’a pas pu être exprimée dans L. Lactis pour des raisons de manque d’efficacité des méthodes de biologie moléculaire employées, dû à la grande taille de son gène. Cependant, des études enzymatiques ont été effectuées sur une P-gp exprimée dans des cellules d’insectes.

Xenobiotics can be toxic for humans, and their biological effects remain difficult to be predicted, due to possible functional interactions between them. Cellular pathway for xenobiotic elimination consists in detoxification process including 3 enzymatic complementary systems, mainly present in liver: phase I enzymes (P450 cytochromes), phase II enzymes (transferases) and phase III active efflux transporters. CYP3A4, MGST1 and P-gp, the membrane proteins involved in this cellular detoxification and chosen in our study, were expressed in the bacterial system Lactococcus lactis using two different cloning strategies: classic and Gateway compatible cloning. It was previously showed that Gateway compatible cloning is an efficient way to produce membrane proteins in L. Lactis. Heterologous expression of CYP3A4 and rat and human MGST1was successfully established, and allowed production of 5% and 1-3% of total membrane proteins, respectively. L. Lactis seems thus to be a suitable expression system for these detoxification enzymes. Pilot functional studies, using membrane fractions showed that only rat MGST1 exhibit some enzymatic activity. Unfortunately, P-gp expression in L. Lactis could not be achieved, because of lack of efficient molecular biological tools (due to the large size of the abcb1 gene). However, enzymatic activity measurements were performed with the P-gp native form produced in transfected insect cells.