Etude du mécanisme de (bio)fonctionalisation de surface de silicium pour l'immobilisation d'enzymes : réalité de l'interface et impact sur l'activité catalytique

Study of the mechanism of (bio) functionalization of silicon surface for the immobilization of enzymes : reality interface and its impact on the catalytic activity

• Auteur / Autrice : Nesrine Aissaoui
• Direction : Jean-François Lambert, Latifa Bergaoui
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique et Chimie des matériaux
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 6 en cotutelle avec INSAT

Mots clés

Mots clés contrôlés

Glucose-6-phosphate déshydrogénase

Enzymes immobilisées

Silane

Résumé

Il est fréquent d'immobiliser des enzymes sur des surfaces planes par diverses méthodes chimiques. Le succès de la procédure d’immobilisation se traduit par le maintien de l’activité catalytique de l’enzyme immobilisée sous des conditions dénaturantes. Dans ce contexte, l’objectif du présent travail est l’étude de l’influence de l’état de l’interface et de son évolution sur le comportement de l’enzyme adsorbée, notamment sur son activité catalytique. Pour ce faire, le système objet du présent travail est une enzyme multimérique (glucose-6-phosphate déshydrogénase, G6PDH) déposée sur une surface de silicium silanisée. Nous nous sommes intéressée pour commencer aux propriétés des films de silane déposés sur le wafer de Si et au réglage fin des paramètres expérimentaux de silanisation (concentration du silane, temps et température de la réaction). Le mécanisme d’interaction des molécules de silane avec la surface de SiO2 dépend fortement du paramètre température de réaction (température ambiante ou haute température : 90 °C). Nous suggérons la présence sur les surfaces de SiO2 de deux sites d’adsorption présentant des affinités différentes pour l’adsorption initiale des molécules de silane. À température élevée, les films de silane obtenus sont plus homogènes et plus stables, comparativement à ceux déposés à basse température. Par conséquent, en vue d’immobiliser ultérieurement des protéines sur des surfaces silanisées, la réaction de silanisation à haute température a été retenue pour la préparation de surfaces silanisées. L’immobilisation covalente de la G6PDH à la surface silanisée peut être réalisée en utilisant des agents de couplage (crosslinkers). Une série de crosslinkers différents ont été comparés. L’effet considérable de la nature du crosslinker sur l’état de l’interface a particulièrement été démontré par une analyse XPS approfondie. Malgré l’instabilité du film de silane après adsorption de l’enzyme sur certains échantillons (surface silanisée sans crosslinker ou en présence de certains crosslinkers), l’enrichissement de la couche organique en enzymes est du même ordre pour quasiment tous les échantillons. Ce résultat met en évidence l’effet considérable des interactions électrostatiques et hydrophobes, capables d'immobiliser des quantités importantes d’enzymes sur les surfaces silanisées sans la présence des liaisons covalentes. Par ailleurs, une étude de l’influence des crosslinkers sur l’activité résiduelle (stabilité opérationnelle et thermique) de l’enzyme immobilisée a été réalisée. Cette étude fournit une information sur les liaisons covalentes présumées, supposées se former en plusieurs points d’ancrage entre les résidus –NH2 de l’enzyme et les groupements réactifs à la surface, selon le modèle ''multipoint''. Un nombre de points de liaisons important entre l’enzyme et la surface permet de maintenir la stabilité de la structure tridimensionnelle de l’enzyme et plus spécifiquement l’ancrage simultané des deux sous-unités qui forment le dimère actif. Par ailleurs, la présence des agrégats a également été considérée comme un facteur stabilisant de la forme dimérique active de l’enzyme immobilisée. L’ensemble de l’étude a démontré que certains crosslinkers produisent un effet doublement avantageux ; d’une part, ils empêchent la dégradation du silane, qui peut se produire au cours de l’adsorption, et d’autre part, ils assurent une immobilisation efficace des enzymes en termes de quantité immobilisée et d’activité catalytique.

The efficiency of enzyme immobilization procedures on inorganic platforms depends on their maintaining the residual activity of the enzyme after immobilization and under denaturating conditions. In this work, we study the influence of the reactive interface and its evolution on the mechanism of enzyme immobilization. To this end, a multimeric enzyme (glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH) is used as a model and immobilized on a silanized silicon surface. First, we focus on the optimization of the silane surface preparation by adjusting the experimental parameters (silane concentration, time and temperature of reaction). The mechanism of silane interaction with SiO2 surfaces strongly depends on the reaction temperature (room temperature or high temperature: 90 °C). We suggest the presence of two adsorption sites with different affinities for silane nucleation on the SiO2 surface. Ordered and stable silane layers are obtained when working at high temperature. Thus, the silanization procedure selected for further studies involved a reaction with silanes at high temperature. The immobilization of enzymes on previously silanized surfaces through covalent bonds could be achieved using crosslinkers. The role of these molecules on interfacial processes was specifically investigated by a detailed analysis of XPS spectra. The stability of silane layers upon enzyme adsorption depends on the used linker. Silanes are significantly eroded in some procedures (silane without linker or in the presence of some linkers); in spite of this, the amount of the immobilized enzyme is almost in the same range for all the samples. This result suggests the ability of hydrophobic and electrostatic interactions to immobilize a high amount of enzyme without the necessity of forming covalent links. The influence of crosslinkers on the residual activity (operational stability and thermostability) of the immobilized enzyme was also investigated. Our study provides information on the presumed covalent bonds which form several anchoring points between the –NH2 residues of the enzyme and the reactive groups at the surface, according to the “multipoint” attachment model. This configuration stabilizes the three-dimensional structure of the enzyme and specifically the binding of the two subunits in the active dimer. Furthermore, the presence of aggregates at the interface may stabilize the active dimeric form of the immobilized enzyme, which could help maintain its catalytic activity. A major conclusion for crosslinking optimization is the ability of some linkers to prevent silane layer degradation and at the same time to provide an efficient immobilization of enzymes in terms of quantity and catalytic activity.