Thèse soutenue

Etude du mécanisme de (bio)fonctionalisation de surface de silicium pour l'immobilisation d'enzymes : réalité de l'interface et impact sur l'activité catalytique

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Auteur / Autrice : Nesrine Aissaoui
Direction : Jean-François LambertLatifa Bergaoui
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Physique et Chimie des matériaux
Date : Soutenance en 2013
Etablissement(s) : Paris 6 en cotutelle avec INSAT

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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Il est fréquent d'immobiliser des enzymes sur des surfaces planes par diverses méthodes chimiques. Le succès de la procédure d’immobilisation se traduit par le maintien de l’activité catalytique de l’enzyme immobilisée sous des conditions dénaturantes. Dans ce contexte, l’objectif du présent travail est l’étude de l’influence de l’état de l’interface et de son évolution sur le comportement de l’enzyme adsorbée, notamment sur son activité catalytique. Pour ce faire, le système objet du présent travail est une enzyme multimérique (glucose-6-phosphate déshydrogénase, G6PDH) déposée sur une surface de silicium silanisée. Nous nous sommes intéressée pour commencer aux propriétés des films de silane déposés sur le wafer de Si et au réglage fin des paramètres expérimentaux de silanisation (concentration du silane, temps et température de la réaction). Le mécanisme d’interaction des molécules de silane avec la surface de SiO2 dépend fortement du paramètre température de réaction (température ambiante ou haute température : 90 °C). Nous suggérons la présence sur les surfaces de SiO2 de deux sites d’adsorption présentant des affinités différentes pour l’adsorption initiale des molécules de silane. À température élevée, les films de silane obtenus sont plus homogènes et plus stables, comparativement à ceux déposés à basse température. Par conséquent, en vue d’immobiliser ultérieurement des protéines sur des surfaces silanisées, la réaction de silanisation à haute température a été retenue pour la préparation de surfaces silanisées. L’immobilisation covalente de la G6PDH à la surface silanisée peut être réalisée en utilisant des agents de couplage (crosslinkers). Une série de crosslinkers différents ont été comparés. L’effet considérable de la nature du crosslinker sur l’état de l’interface a particulièrement été démontré par une analyse XPS approfondie. Malgré l’instabilité du film de silane après adsorption de l’enzyme sur certains échantillons (surface silanisée sans crosslinker ou en présence de certains crosslinkers), l’enrichissement de la couche organique en enzymes est du même ordre pour quasiment tous les échantillons. Ce résultat met en évidence l’effet considérable des interactions électrostatiques et hydrophobes, capables d'immobiliser des quantités importantes d’enzymes sur les surfaces silanisées sans la présence des liaisons covalentes. Par ailleurs, une étude de l’influence des crosslinkers sur l’activité résiduelle (stabilité opérationnelle et thermique) de l’enzyme immobilisée a été réalisée. Cette étude fournit une information sur les liaisons covalentes présumées, supposées se former en plusieurs points d’ancrage entre les résidus –NH2 de l’enzyme et les groupements réactifs à la surface, selon le modèle "multipoint". Un nombre de points de liaisons important entre l’enzyme et la surface permet de maintenir la stabilité de la structure tridimensionnelle de l’enzyme et plus spécifiquement l’ancrage simultané des deux sous-unités qui forment le dimère actif. Par ailleurs, la présence des agrégats a également été considérée comme un facteur stabilisant de la forme dimérique active de l’enzyme immobilisée. L’ensemble de l’étude a démontré que certains crosslinkers produisent un effet doublement avantageux ; d’une part, ils empêchent la dégradation du silane, qui peut se produire au cours de l’adsorption, et d’autre part, ils assurent une immobilisation efficace des enzymes en termes de quantité immobilisée et d’activité catalytique.