Cycle d'assemblage de la tubuline en microtubule : Etude biochimique et structurale de l'effet du nucléotide et de protéines séquestrantes

Tubulin assembly on microtubule : biochemical and structural study of tubulin-sequestering proteins

• Auteur / Autrice : Agata Nawrotek-Maalouf
• Direction : Marcel Knossow, Benoît Gigant
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biophysique. Biochimie
• Date : Soutenance en 2013
• Etablissement(s) : Paris 6

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microtubules

Tubulines

GTPases

Résumé

Les microtubules sont des filaments dynamiques du cytosquelette des cellules eucaryotes, formés par assemblage d’une protéine globulaire hétéro dimérique appelée tubuline. Pour pouvoir s’assembler, la tubuline doit être sous forme GTP (c’est-à-dire avec sa sous-unité β chargée en GTP). L’assemblage s’accompagne de l’hydrolyse du GTP conduisant au paradoxe que les microtubules sont constitués essentiellement de tubuline-GDP, qui par elle-même ne s’assemble pas en microtubule. Structuralement, la tubuline alterne entre une conformation droite au sein des microtubules et une conformation courbe en solution. Le but de mes travaux de thèse était d’identifier les déterminants structuraux qui rendent la tubuline GTP apte à s’assembler par rapport à la forme GDP. Je me suis intéressée également au mécanisme de régulation de la dynamique des microtubules par les protéines CPAP et CopN. J’ai déterminé la structure des formes GTP et GDP de la tubuline, à haute résolution, en complexe avec le domaine stathmine de la protéine RB3 (T2R). Ces résultats indiquent qu’à la fixation du GTP, la tubuline garde une même forme générale et que les différences sont limitées au niveau de site du nucléotide. J’ai pu proposer un mécanisme d’assemblage selon lequel la fixation du GTP favorise les associations longitudinales, tête-à-queue, de tubulines au sein de protofilaments. Le passage entre formes courbe et droite se produirait ensuite, avec l’établissement de contacts latéraux entre tubulines de protofilaments voisins. Pour CopN comme pour CPAP, mes résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour une approche structurale de l’étude de leur mécanisme d’action

Microtubules are dynamic elements of the cytoskeleton of eukaryotic cells. They are formed by the assembly of an αβ heterodimeric protein, tubulin. The assembly of GTP-tubulin (i. E. With the β subunit loaded with GTP) is accompanied by GTP hydrolysis leading to the paradox that microtubules are mainly composed of GDP-tubulin, which by itself does not assemble in microtubules. Structurally, tubulin alternates between a straight conformation in microtubules and a curved conformation in solution. One purpose of my thesis was to identify the structural determinants that render GTP-tubulin competent for assembly as compared to the GDP form. I have determined the structure of the GDP and GTP forms of tubulin, at high resolution, in complex with the stathmin-like domain of the RB3 protein. These results indicate that tubulin keeps the same general curved shape whether it is bound to GTP or GDP, the differences between theses two forms being limited to the vicinity of the nucleotide binding site. From these results, I propose a model for assembly according to which the binding of GTP promotes longitudinal, head-to-tail, associations between tubulins within protofilaments. The transition between the straight and curved forms will happen later on in the assembly process, when contacts between tubulins of neighboring protofilaments are established. During my thesis, I was also interested in the mechanism of the interaction between tubulin and two proteins, CPAP and CopN. My work on CopN and on the PN2-3 domain of CPAP opens new perspectives to study their interaction with tubulin by structural approaches